百草枯（paraquat,PQ）中毒患者晚期可出现肺泡内及肺间质成纤维细胞增殖和细胞外基质（ECM）异常沉积,出现不可逆性肺纤维化,最终导致呼吸衰竭,是中毒致死的主要原因。研究表明,ECM大量异常堆积不但是肺纤维化特征性病理结果,反之异常的ECM也会加重肺纤维化进程,两者互为因果。整合素β1属细胞黏附分子,分布于细胞外骨架结构和细胞表面,具有机械和化学双向信号传输通道,通过感受细胞内外刺激产生一系列生物学反应,被认为是细胞内外连接的桥梁。通过形成ECM-整合素-细胞骨架系统,介导FAK-Src-p130Cas机械化学传导通路,继而激活下游多条信号传导通路,其中丝裂素激活蛋白激酶（FAK-Ras-MAPK）通路被认为与纤维化疾病关系密切。但目前有关整合素β1（Integrin β1,Itgb1）介导机械化学传导通路在百草枯诱导肺纤维化中的作用及机制尚不明确。本研究拟从肺纤维化细胞外微环境改变角度出发,阐明百草枯诱导肺纤维化ECM微环境结构成分改变对肺成纤维细胞活化成肌成纤维细胞的作用,并明确整合素β1介导的机械化学传导通路在百草枯诱导肺纤维化中的作用与机制。第一部分百草枯诱导肺纤维化去细胞支架差异小分子蛋白质组学研究目的:探讨百草枯中毒导致肺纤维化细胞外基质小分子蛋白质变化情况。方法:健康成年雄性SD大鼠15只,随机数字表法分为A、B、C三组,每组5只,A组为正常对照组,B、C组分别为百草枯染毒2周与4周组。利用去细胞技术制备正常及肺纤维化去细胞支架（ECM）,高效液相色谱-电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS-MS）测试分析差异表达小分子蛋白质（DESMPs）在不同组间和亚细胞位置的表达。结果:1.建立肺纤维化模型,并制备正常肺及肺纤维化去细胞支架。2.通过差异小分子蛋白质组学分析技术,在大鼠肺纤维化去细胞支架中发现了大量百草枯诱导的差异DESMPs。正常对照组和百草枯组的DESMPs在分子功能、生物进程和生物途径上表现出多样性,相互作用关联度最高的DESMPs蛋白分别为白蛋白（Alb）、整合素β1、载脂蛋白（Apoa1）、脯氨酰基-4-羟化酶β（P4hb）和纤维蛋白原基因（Fgg）,与正常去细胞支架比较,肺纤维化去细胞支架中整合素β1蛋白表达明显升高。结论:百草枯中毒诱导的肺纤维化去细胞支架（纤维化ECM）有大量差异表达的小分子蛋白质,整合素β1做为主要DESMPs在百草枯诱导的肺纤维化发病机制中可能扮演重要作用。第二部分整合素β1在百草枯诱导大鼠肺纤维化中的作用与机制研究目的:探讨整合素β1介导机械化学传导通路在百草枯诱导大鼠肺纤维化中的作用及可能机制。方法:健康成年雄性SD大鼠18只,随机数字表法分为3组（n=6）,分别为正常对照组（Control组）、百草枯中毒组（PQ组）及整合素β1抑制剂组（ATN组）。苏木素-伊红（HE）、Masson、天狼星红染色及羟脯氨酸含量测定评估各组肺纤维化程度;蛋白印迹法（Western blot）、RT-PCR分别检测各组整合素β1介导的机械化学通路（FAK、Src、p130Cas）及其下游丝裂素激活蛋白激酶（FAK-Ras-MAPK）通路（MEK1/2、ERK1/2、p38 MAPK）蛋白基因表达及其蛋白磷酸化水平。结果:1.成功构建百草枯诱导的大鼠肺纤维化模型:HE、Masson、天狼星红染色均显示百草枯中毒组肺组织中肺泡破坏明显,胶原纤维增生明显,ATN组示肺组织肺泡较完整、清晰,组织结构无明显破坏。百草枯中毒组肺组织羟脯氨酸含量明显升高（P＜0.05）,ATN组肺组织羟脯氨酸含量较百草枯中毒组明显下降（P＜0.05）。2.Western blot结果示:PQ组t-FAK、p-FAK、t-Src、p-Src、t-p130Cas、p-p130Cas、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白表达较正常对照组明显升高（P＜0.05）,t-p38 MAPK蛋白表达较正常对照组有升高趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）;与PQ组比较,ATN组t-FAK、p-FAK、t-Src、p-Src、t-p130Cas、p-p130Cas、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白表达明显下降（P＜0.05）,t-p38MAPK蛋白表达有下降趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）。3.RT-PCR结果示:PQ组FAK、Src、p130Cas、MEK1 和MEK2 mRNA表达较正常对照组升高（P＜0.05）,p38 MAPK mRNA表达较正常对照组有升高趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）;与PQ组比较,ATN组FAK、Src、p130Cas、MEK1 和MEK2 mRNA表达明显下降（P＜0.05）,p38 MAPK mRNA表达有下降趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:1.整合素β1介导的机械化学传导通路及其下游FAK-Ras-MAPK信号通路的激活可能是百草枯诱导大鼠肺纤维化的重要发病机制之一。2.整合素β1抑制剂ATN-161可通过抑制机械化学传导通路,下调下游ERK1/2信号通路,或抑制下游ERK1/2和p38MAPK通路磷酸化水平,缓解百草枯诱导的大鼠肺纤维化。3.整合素β1抑制剂ATN-161有望成为百草枯肺纤维化临床干预治疗的新靶点,ATN-161是潜在的抗肺纤维化药物。第三部分肺纤维化去细胞支架促成纤维细胞活化中的作用与机制研究目的:探讨整合素β1在百草枯诱导肺纤维化去细胞支架促成纤维细胞活化中的作用与机制。方法:构建成纤维细胞与肺去细胞支架体外共培养体系,细胞实验分为5组:A组为无支架组,B组为正常支架组,C组为正常支架+整合素β1抑制剂组,D组为肺纤维化支架组,E组为肺纤维化支架+整合素β1抑制剂组。分别通过免疫荧光染色和RT-PCR检测各组成纤维细胞波形蛋白（Vimentin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）蛋白和基因的表达。结果:1.免疫荧光染色显示:正常与肺纤维化支架组Vimentin、α-SMA及p-ERK1/2蛋白荧光亮度均较无支架组变亮,其中肺纤维化支架组荧光亮度强阳性,较正常支架组（阳性）更为明显,正常与肺纤维化支架+整合素β1抑制剂组的荧光亮度则明显变弱,呈弱阳性表达。2.RT-PCR结果显示:正常与肺纤维化支架组Vimentin、α-SMA、ERK1和ERK2 mRNA表达均较无支架组升高（P＜0.05）,其中肺纤维化支架组Vimentin、α-SMA、ERK1和ERK2 mRNA表达较正常支架组明显升高（P＜0.05）;与肺纤维化支架组比较,肺纤维化支架+整合素β1抑制剂组Vimentin、α-SMA、ERK1和ERK2 mRNA表达则明显下降（P＜0.05）。结论:1.百草枯诱导的肺纤维化去细胞支架可促成纤维细胞活化作用;2.整合素β1可能通过上调下游ERK1/2信号通路表达,或抑制其蛋白磷酸化参与肺纤维化ECM促成纤维细胞活化作用。