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·第一部分中性粒细胞胞外诱捕网在肿瘤进展中的意义及其预后价值·第一章分泌粒细胞-集落刺激因子及浸润性中性粒细胞增多的乳腺癌亚型背景:肿瘤细胞之所以能够发展成瘤,不仅是实质细胞遗传物质改变,获得恶性表型的结果,促癌性的免疫微环境也在此发挥了重要作用。肿瘤细胞与免疫细胞的交互作用也是影响肿瘤进展的重要因素。但传统上,用于分类乳腺癌预后或疗效的基因标志物,主要与细胞增殖相关。忽视了其他肿瘤相关生物学过程,以及肿瘤免疫微环境在肿瘤发生发展中的意义。目的:拟从肿瘤相关生物学过程及各免疫细胞亚型的基因集出发,探索建立一种与预后相关的乳腺癌分子分型。并探索中性粒细胞胞外诱捕网在新亚型中的意义。材料及方法:本研究纳入TCGA数据库中985例乳腺癌浸润性导管/小叶癌的肿瘤组织转录组数据,结合基因集变异分析方法,以Hallmark基因集评估肿瘤相关生物学过程,以免疫细胞亚型相关基因集评估乳腺癌的免疫微环境模式,探索新的乳腺癌分子分型。利用“细胞迁移及中性粒细胞胞外诱捕网检测系统”验证中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)在乳腺癌进展中的意义。结果:本研究利用上述方法,将TCGA数据库中的乳腺癌样本分为三组,命名为Hallmark-tsne分子分型。刻画Hallmark-tsne分型中的C3亚型发现,其是一类运动迁移能力增强、具有肿瘤干细胞样表型、高表达Luminal表型相关基因,并且以中性粒细胞高度浸润为特征的乳腺癌。另外,C3亚型乳腺癌G-CSF高表达与中性粒细胞大量浸润的现象相伴生。分泌G-CSF的乳腺癌细胞可以诱导中性粒细胞形成中性粒细胞胞外诱捕网,从而增强癌细胞的迁移能力。结论:刻画乳腺癌相关生物学过程及免疫微环境,不仅对其分子分型具有重要意义,并且对指导患者的“个体化”治疗也具有一定价值。由NETs形成所介导的促癌性免疫微环境可加速肿瘤进展。·第二章中性粒细胞胞外诱捕网协同凝血系统保护肾癌患者外周血循环肿瘤细胞的存活背景:多数肿瘤患者因癌症转移或复发而非局限性肿瘤去世。然而截至目前,对于循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)如何在外周血中获得生存,这一转移的关键环节知之甚少。肿瘤患者的C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)升高或血小板增多往往预示患者预后不良、复发风险较高。中性粒细胞不仅是维持炎症反应的重要参与者,其一种特殊的激活态-NETs也是介导凝血级联反应的重要组分。虽然肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是发病率较低的一类小癌种,但已发生远处转移的肾癌患者,其5年生存率仅有8%-12%,并且晚期肾癌患者体内炎症反应明显,易伴发形成深静脉瘤栓。目的:探索外周血中性粒细胞的特殊激活形式NETs所介导的炎症及高凝环境是否有利于CTCs的存活。材料及方法:本章共纳入106例初治肾占位患者(9例肾脏良性占位及97例肾细胞癌),利用oHSV1-hTERT-GFP病毒法计数患者外周血有活性的CTCs数量,并收集整理了 106例患者的基本临床信息、术前外周血常规及生化检查结果;对其中21位患者行外周血白细胞转录组测序,利用GSEA等基因集富集评分相关算法计算NETs等免疫表型评分;进而比较检出CTCs的数量与患者免疫表型评分之间的关系。最终,以TCGA数据库中透明性肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)肿瘤组织转录组数据评估NETs与患者预后的关系。结果:初治时CRP或FIB升高的患者,其外周血所检出的CTCs数量明显升高,且CTCs数量、CRP及FIB两两间均呈现正相关关系。结合外周血白细胞表达谱数据发现,CTCs数量较多的肾癌患者,其白细胞表现为类似于低密度中性粒细胞(low density neutrophils,LDNs)的自发激活态或被G-CSF刺激下的应激状态,也即NETs生成态。并且,基于表达谱的NETs评分与血浆FIB浓度间也呈现正相关关系;且外周血CRP升高的患者,其NETs及凝血评分较高。在形态学上观察到,NETs所释放的DNA网状骨架上镶嵌有NETs源性组织因子(tissue factor,TF);且体外模拟实验已证实NETs可包裹单个的肾癌细胞。另外,分析ccRCC患者肿瘤组织的表达谱数据可知,NETs评分及TF表达值是影响患者预后的独立危险因素。结论:炎症状态下,NETs释放的DNA网状骨架,及NETs源性TF激活凝血系统所生成的纤维蛋白网,共同构成了 CTCs得以生存的保护网。·第三章基于中性粒细胞胞外诱捕网的泛癌预后评分系统背景:肿瘤作为一类“无法愈合的创口”可引发全身系统性病理改变。尽管浸润性中性粒细胞曾致力于修复创口,但以倒戈相向为终,而且其特殊存在形式NETs成为了维持机体慢性炎症、高凝易栓状态的重要力量。NETs的存在为肿瘤进展创造了舒适的微环境,其参与了肿瘤转移、瘤床内血管生成、肿瘤相关性血栓形成及终末期多器官衰竭等可致肿瘤患者去世的多种主要病理过程。尽管来源于不同克隆的肿瘤实质细胞间存在异质性,寻找肿瘤细胞间共有的遗传变异比较困难,但瘤床中也许存在某种物质是促进肿瘤恶性进展的共有因素。目的:从促癌性免疫微环境角度,探索NETS是否是影响泛癌(pan-cancer)预后的共有因素,并以此为基础训练简洁实用的泛癌预后预测模型。材料及方法:本研究纳入了 TCGA数据库中32种实体瘤,共8739例泛癌原发灶表达谱数据,随机抽取70%患者(6117例)作为训练集,其余30%(2622例)作为泛癌测试集。在泛癌训练集中,采用Lasso回归筛选了 19个NETs相关特征基因,用于构建Cox 比例风险回归模型;另外根据特征基因在生存树中预测预后的贡献度,选取了前12个特征基因用于构建生存随机森林模型。根据上述模型,计算训练集和测试集内各患者的NETs(Cox)评分和NETs(RF)评分。根据数据中位值将患者分为高危组和低危组,绘制Kaplan-Meier生存曲线;利用时间依赖ROC曲线、DCA曲线及一致性指数检验模型效能。结果:在泛癌训练集中,NETs(Cox)评分及NETs(RF)评分较高的高危组患者的疾病相关生存期(disease specific survival,DSS)、总生存期(overall survival,OS)及无进展间隔(progression free survival,PFI)较低危组明显缩短;同样,在泛癌测试集、胶质瘤测试集、乳腺癌和肺腺癌测试集中,NETs(Cox)及NETs(RF)评分较高的高危组患者,OS明显缩短。对于泛癌训练集中的30种实体瘤(除外DLBC和KICH),单因素Cox风险回归显示,NETs(RF)评分是导致患者生存期显著缩短的危险因素。时间依赖ROC曲线和DCA曲线均说明认为NETs(RF)评分评估预后更为准确;但在不同时间点上,NETs(Cox)评分的预测效能更稳定。此外,分析TCGA数据库8739例泛癌原发灶的 NETs(z-score)、Angiogenesis(z-score)及 Cellcycle(z-score)值发现,三者间互为正相关关系,在数据上证明了 NETS的形成,可介导瘤床血管生成、促进肿瘤细胞增殖。此为NETs相关基因可预测泛癌预后提供了理论支持。结论:本章建立的NETs评分模型可预测泛癌患者预后。·第二部分不同肿瘤负荷下的外周血T细胞受体库动态特征谱及其预后预测价值背景:肿瘤细胞是一类具有免疫原性的异常转化的细胞。肾细胞癌是一类免疫原性较强的癌种,其在免疫系统监视作用下可自发地、或是经细胞因子诱导后而消退。肿瘤与机体免疫系统是相互竞争共同进化的:一方面肿瘤的免疫原效应可诱导动员免疫系统生成肿瘤相关T细胞;但另一方面,伴随肿瘤抗原的持续性刺激,T细胞受体(T cell receptor,TCR)识别抗原的敏感性降低,加之肿瘤自身进化产生的防御系统,可使T细胞失去杀伤能力。T细胞在肿瘤免疫编辑的不同阶段执行不同的功能,TCR多样性是映射T细胞功能状态的一项重要指标。目的:探索不同的肿瘤负荷及肿瘤负荷改变后对机体TCR免疫组的影响,评估TCR多样性的预后价值;评估减瘤性肾切除术对晚期患者免疫系统的影响及其治疗价值。材料及方法:本研究共纳入50例肾占位患者。其中38例初治透明性肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)患者及2例初治肾良性占位患者,记为”手术相关病例队列”,对其术前及术后1周的外周血行T细胞受体库测序(T cell receptor repertoire sequencing,TCR-seq),并对其中28例患者术前术后外周血行转录组测序。分析手术前后TCRβ链(TCRB)多样性及基于表达谱的免疫细胞亚型的变化谱。另外,其中13例同期转移性肾癌及5例异时性转移肾癌患者共同组成了“转移性肾癌病例队列”,行TCR-seq,通过计算TCRB多样性来评估患者预后。为验证结果,对1例初治Ⅰ期ccRCC患者、1例初治的Ⅲ期伴下腔静脉瘤栓的ccRCC患者外周血行流式检测,比较手术前后耗竭性T细胞变化状态;对1例初治Ⅳ期同期转移性ccRCC患者的手术前后外周血行单细胞转录组及免疫组测序。结果:整合TCR-seq及转录组结果发现,TCRB多样性较低的患者体内炎症反应剧烈,并且处于相对高凝的状态;而TCRB多样性较高的患者的免疫状态维持于相对稳态,储备了大量的幼稚T细胞。在治疗基线时,肿瘤负荷较低的Ⅰ期患者TCRB多样性明显高于肿瘤负荷较高的Ⅳ期患者。对Ⅳ期患者而言,治疗基线的TCRB多样性越高,总生存期越长;接受减瘤性手术治疗后,患者外周血TCRB多样性得以恢复(TCRB克隆总体上呈现小丰度克隆新生、超大克隆缩小),耗竭性T细胞比例减少,幼稚T细胞增多,整体免疫环境得到改善,免疫监视能力得以恢复。结论:肿瘤负荷高的患者外周血TCRB多样性差,TCRB多样性可评估晚期患者的预后;减瘤性肾切除术可以有效改善Ⅳ期患者的整体免疫状态。