论文部分内容阅读
隐花色素是一种能够感受蓝光和近紫外光的光受体,它与大肠杆菌光裂解酶是同源蛋白,其辅基为FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)。拟南芥隐花色素CRY的蛋白结构域由两部分组成:N端结构域序列与大肠杆菌光裂解酶类似,但不具备DNA修复活性,故又称为PHR(Photolyase-Homologous Region)结构域;C端结构域又叫CCE结构域(Cryptochrome C-terminal Extension),该结构域不稳定,保守性较低,是分子内信号输出的区域,又称为效应结构域。目前对于隐花色素的光敏原初反应如:光激活的详细分子机制,隐花色素CRY2的负调控因子BICs抑制CRY2二聚化机理以及隐花色素参与生物钟网络调控的分子机制仍有待深入的研究。研究表明PHR结构域是隐花色素CRY发生同源二聚化的区域,且光激活的CRY是以二聚体发挥其生理功能的,因此深入研究拟南芥CRY的二聚化分子机制对于理解CRY的光激活反应机理以及其参与的下游信号通路具有重要的意义。本实验室的前期研究通过构建CRY2的全部半胱氨酸的点突并利用多种氧化还原剂(β-巯基乙醇、N-乙基马来酰亚胺、聚乙二醇马来酰亚胺)的化学修饰方法证明了蓝光特异性条件下的CRY2蛋白二聚体、多聚体的形成是由半胱氨酸形成的二硫键介导的。本文是在上述研究的基础上对调控CRY2蓝光特异性的二聚体、多聚体的二硫键半胱氨酸位点进行了鉴定,通过使用高效便捷的HEK293T细胞作为主要的研究工具,结合改进的Split-Luciferase(荧光素酶互补)系统分析荧光值的表达情况以及BiFC(双分子荧光互补技术)技术观察蓝光特异性CRY2光小体的形成,鉴定了 CRY2二聚化的二硫键键位。通过AGROBEST方法进一步在拟南芥植物体内验证了介导CRY2二聚体、多聚体形成二硫键的半胱氨酸位点。二硫键对于维持蛋白质的高级结构,保持其功能活性具有重要的作用,对蛋白及蛋白复合体中二硫键的精确鉴定还需要借助质谱和软件进行分析,本研究还利用了 IP-MS串联的方法对介导CRY2二聚体的二硫键进行了初步分析鉴定。BICs作为调节CRY2光敏性的负调控因子,已有证据证明BICs是通过直接与CRY2相互作用来抑制蓝光特异性CRY2的二聚化、多聚化,光小体的形成,磷酸化,降解和CRY2的其他生理活性。本研究还通过构建BICs-CRY2的HEK293T细胞表达载体对BICs与CRY2的作用机制进行了初步研究,为深入研究CRY2光激活与失活的光敏性分子机制提供了一定的研究基础。通过上述研究获得以下结论:1.通过优化的HEK293T细胞表达系统,构建了拟南芥CRY2全部的1 1个半胱氨酸的点突,利用Split-Luciferase(荧光素酶互补技术)系统鉴定出了 CRY2 C39S、CRY2 C89S、CRY2 C158S、CRY2 C187S、CRY2 C583S 这 5 个半胱氨酸形成的二硫键参与了 CRY2二聚体的形成,其中CRY2第89号半胱氨酸形成的二硫键起主要调控作用。2.利用BiFC实验观察蓝光特异性CRY2光小体的形成发现CRY2的第39、89、158、187、583号半胱氨酸不仅调控了 CRY2二聚体、多聚体的形成,甚至参与了光小体的形成。3.构建Split-Luciferase的植物表达载体并利用AGROBEST方法侵染cry2突变体的拟南芥,结果显示了第39、89、158、187、583号半胱氨酸点突变CRY2的荧光值有不同程度的降低,这些结果从植物体内地验证了这5个半胱氨酸形成的二硫键介导了 CRY2二聚化。4.BIC1对CRY2二聚体的抑制在一定范围内存在剂量效应,并且鉴定了 BICs对CRY2结合抑制并不是由半胱氨酸介导竞争性的二硫键形成的,详细的分子机制有待深入的研究。