研究背景克罗恩病(Crohn’s disease,CD)是一种原因不明的肠道炎症性疾病,多反复发作,难以根治。CD肠道纤维化引起的肠道狭窄梗阻是导致临床患者需要手术治疗的常见并发症,且手术只能解除梗阻的症状,并不能阻止纤维化的复发和进展。肠系膜增厚及脂肪堆积是CD的特征性表现之一,肠系膜的增厚与肠道纤维化部位常呈现一一对应的关系,肠系膜内脂肪细胞与CD的肠道纤维化、肌层增厚和肠道狭窄存在着密切联系,但具体作用及机制尚不明确。肠系膜内的脂肪细胞具有内分泌及免疫调节功能,其分泌的大量脂肪因子是调节肠道功能的重要因素,其中脂联素是具有多种功能的重要分子。脂联素已被证实参与了肠道炎症的发生发展,但其对CD相关的肠道纤维化的作用尚未有研究报道。研究目的1、分析脂联素在CD患者不同肠道组织及其对应肠系膜中的表达与CD肠道纤维化病变之间的关系;2、验证外源性脂联素对CD肠道纤维化的治疗作用;3、探讨脂联素影响CD肠道纤维化的潜在机制。研究方法前瞻性收集CD肠道纤维化狭窄患者的手术标本,分别取狭窄部位肠壁及其对应的肠系膜组织以及同一患者相对正常的肠壁及其对应的肠系膜组织。将肠道标本石蜡包埋后制成切片,通过苏木素-伊红和马松三色染色法分别观察狭窄和非狭窄肠道的肠壁结构差异以及纤维蛋白沉积情况;通过免疫组织化学法观察狭窄和非狭窄肠道、肥厚和正常肠系膜中脂联素与胶原蛋白I的表达情况;实时定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹法分别验证狭窄与非狭窄肠道及对应肠系膜中脂联素和胶原蛋白I在核糖核酸和蛋白质水平的表达情况。36只8周龄雌性无特定病原体级BALB/c小鼠,随机均分成对照组、建模组和治疗组。建模组和治疗组采用剂量递增的三硝基苯磺酸溶液连续灌肠7周的方法构建肠道纤维化的小鼠模型。治疗组小鼠于三硝基苯磺酸最后一次灌肠后的第3天腹腔注射脂联素。腹腔注射一周后,行小鼠肠镜检查,观察肠道炎症及狭窄情况,并进行内镜下评分,随后取结肠组织,记录结肠长度与最后7厘米的重量。苏木素-伊红和马松三色染色法观察各组小鼠的肠道肌层厚度和纤维蛋白沉积情况,并进行纤维化评分;免疫组织化学法、实时定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹法对比各组小鼠肠道内脂联素和胶原蛋白I的表达情况,并检测髓过氧化物酶活性和炎症因子的表达情况。提取患者肠道标本的成纤维细胞进行原代培养,通过流式细胞技术检测细胞表面标记物,免疫荧光法检测细胞内波形蛋白和平滑肌肌动蛋白表达情况。采用转化生长因子刺激原代成纤维细胞构建纤维化的细胞模型;实时定量聚合酶链式反应检测波形蛋白和平滑肌肌动蛋白的表达情况,以观察脂联素共培养对纤维化细胞模型的影响;采用蛋白质印迹法检测脂联素干预后原代成纤维细胞内的信号通路变化情况;采用化学通路抑制剂反向验证脂联素影响的信号通路。研究结果1、相对于正常的肠系膜,狭窄肠道所对应的肥厚肠系膜中,脂肪细胞的体积更小,数量更多,密度更高;2、狭窄肠道的基础结构受到破坏,失去正常的层次结构,呈现出瘢痕化状态,其内纤维化蛋白和胶原蛋白沉积明显;3、肥厚肠系膜中的脂联素表达量显著高于正常肠系膜。狭窄肠道中的脂联素表达高于正常肠道,但这种升高并没有统计学差异;4、外源性输注脂联素能够明显减轻三硝基苯磺酸诱导的纤维化模型小鼠的肠道炎症和纤维化改变;5、脂联素共培养能够抑制转化生长因子诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞细胞转化现象;6、脂联素能够通过抑制转化生长因子诱导的Smad蛋白的磷酸化,从而抑制胶原蛋白的沉积,而这种作用能够被腺苷酸活化蛋白激酶的通路抑制剂所阻断。研究结论脂联素能够促进腺苷酸活化蛋白激酶的磷酸化来抑制转化生长因子介导的成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化,从而达到防治纤维化的作用。脂联素有望成为用于治疗克罗恩病肠道纤维化的新型药物。