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由水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarfvirus,RBSDV)引起的水稻黑条矮缩病近年来在我国多个省区先后爆发流行。植株一旦染毒便不可防治,严重发生时可造成巨大的产量损失。由于缺乏高抗种质资源和主效抗病基因,使得通过传统育种手段难以培育抗病品种。本实验室之前证实,在水稻中组成型表达S6RNA基因产生针对黑条矮缩病毒基因S6的特异RNA干涉片段可获得高抗病水稻。本研究在此基础上采用双T-DNA转化策略,利用水稻绿色组织特异表达启动子Osrbcs驱动S6RNAi表达,转化感病粳稻品种淮稻5号(HD5),以创制绿色组织特异表达的无标记抗黑条矮缩病转基因水稻育种新材料。主要结果如下:1、构建了 Osrbcs::S6RNAi的双T-DNA植物表达载体,通过农杆菌介导法将其转入HD5中,获得79个靶基因阳性植株,其中97.4%的植株中同时携带筛选标记基因(HPT);通过Southern杂交,发现大多数转基因植株中携带2个以上靶基因或筛选标记基因,单拷贝较少。通过连续世代的PCR和Southern杂交检测,最终获得5个Osrbcs::S6RNAi的无标记转基因系。2、通过抗黑条矮缩病自然鉴定及部分株系的人工鉴定,证实Osrbcs::S6RNAi基因可用于抗黑条矮缩病转基因水稻的培育;转化子89号的相关株系高抗黑条矮缩病,在人工接种鉴定中的发病率均不到5%,远低于感病对照HD5的发病率(大于80%),在多次自然鉴定中也表现较强的抗性;通过Northern杂交,证实89号转化子的后代株系中的S6RNAi表达最强;从89号转化子的后代中筛选到8份高抗黑条矮缩病株系,其中2个为无标记株系,各株系均携带三个或两个S6RNAi基因拷贝。与对照相比,Osrbcs::S6RNAi转基因系均存在不同程度的农艺性状变化,其中89号转化子的相关株系的农艺性状总体较好。3、对实验室之前获得的由组成型启动子Ubi驱动表达的Ubi::S6RNAi转基因材料进行自然鉴定,从4个单拷贝转化子(10-5、11-5、7-9、9-4)后代中分别筛选到1个或多个高抗黑条矮缩病无标记转基因系;利用部分转化子分别与受体亲本武陵粳1号(WLJ1)间杂交并经连续自交世代选择,获得一批综合性状明显改善的改良系,如转化子11-5的早衰性状在改良系中得到了明显改善,部分改良系的抗病表型也得到了初步鉴定确认;通过Northern杂交,证实这4个单拷贝转化子的相关株系及其衍生的改良系中S6RNAi基因均有较强表达;通过反向PCR技术,明确了转化子10-5、11-5、7-9和9-4中的Ubi::S6RNAi基因分别插在水稻第6染色体的26.82Mb和7.69Mb、第12染色体的24.27Mb和4.97Mb位置处。本研究获得的以上转基因中间材料对于进一步培育高抗黑条矮缩病转基因水稻提供了丰富的材料基础,具有重要的实际意义。