论文部分内容阅读
研究目的:肿瘤的转移是一个错综复杂的过程,不同信号通路和多种调控分子在其中交互影响,彼此发挥不可替代的作用。这种生物学行为的发生是由肿瘤细胞形态伴随分子特性向间充质表型转化所导致的,在细胞获得了间充质特性后会更容易迁移和侵袭至其他身体部位,此过程称为上皮向间充质转化(Epithelia-Mesenchymal Transition)过程,简称EMT。而当肿瘤细胞抵达所种植部位开始增殖逐渐形成第二病灶时,细胞又会从转移性强的间充质特性重新恢复成上皮特性,此时称简直上皮转化(Mesenchymal-epithelial Transition,MET)。SND1蛋白作为一种多功能蛋白在细胞内广泛表达,现已证实可作为一种癌症相关分子参与多种实体肿瘤的发生,同时对肿瘤转移起到促进作用。本实验室前期结果显示,在乳腺癌细胞中SND1蛋白与TGFβ信号通路相互作用共同促进肿瘤转移的发生;而在卵巢组织切片中我们发现与卵巢囊腺瘤样本相比,SND1蛋白的表达在上皮型卵巢癌中呈现强阳性,同时在交界型样本中部分表达;而在良性囊腺瘤样本中具有侵袭趋势部位的细胞其SND1的表达明显高于邻近正常部位,同时在交界性样本中,偏向恶性部分的肿瘤呈现乳头状生长且SND1表达明显高于对侧偏良性部位,这就提示我们SND1蛋白极有可能参与卵巢癌细胞的转移,但具体调控机制还尚未明确。因此本课题将分为三部分进行研究,目的旨在探讨SND1蛋白是否参与卵巢癌细胞的转移及其具体分子机制。研究方法:一、SND1促进卵巢癌细胞SKOV3上皮向间充质转化(EMT)过程(1)用慢病毒感染野生型SKOV3细胞,构建稳定敲低SND1蛋白的SKOV3细胞株和对照细胞株,倒置显微镜观察细胞形态变化并用Western Blot验证蛋白敲低效率。(2)用划痕实验检测对照组和实验组细胞的迁移能力;用侵袭小室实验验证对照组和实验组细胞的侵袭能力。(3)用慢病毒构建稳定表达Luciferase的SKOV3细胞,随后再次感染慢病毒敲低SND1蛋白,腹腔注射至免疫缺陷小鼠体内。注射四周后利用小动物活体成像发光仪器观察小鼠腹腔内荧光强度及其范围;注射六周后剖腹探查小鼠体内肿瘤播散及生长差异。(4)表达谱芯片检测对照组和SND1敲低组细胞间mRNA表达差异并用实时定量PCR技术验证芯片结果。(5)利用免疫荧光技术检测上皮和间质型标志蛋白在细胞中的定位同时用Western Blot方法检测表达变化。(6)在敲低SND1蛋白的细胞株中利用慢病毒重新恢复SND1的表达并用Western Blot验证相关分子的表达,利用划痕和侵袭小室实验验证细胞迁移侵袭能力,用免疫荧光实验检测相关分子的定位。二、SND1通过调控SLUG表达促进SKOV3细胞EMT的发生(1)在芯片结果中寻找可能受SND1蛋白调控的下游分子SLUG并在不同SND1蛋白表达水平的细胞株中验证SLUG的表达是否与SND1有关。(2)构建带有HA标签的过表达SLUG质粒,同时构建CrisprCas9质粒敲除 SLUG。(3)利用上述质粒构建SLUG相关对照组和实验组的稳定株细胞并用Western Blot检测相关分子蛋白表达水平。(4)利用划痕和侵袭小室实验检测SKOV3细胞中SLUG对细胞迁移和侵袭能力的影响。(5)在低表达SND1的细胞株中恢复SLUG的表达并用Western Blot检测蛋白分子表达量,划痕实验和侵袭小室实验验证细胞转移能力是否发生相应改变。(6)在过表达SND1的细胞株中敲除SLUG并用Western Blot检测蛋白分子表达量,划痕实验和侵袭小室实验验证细胞转移能力是否发生相应改变。三、SND1招募组蛋白乙酰转移酶促进SLUG基因转录(1)构建含有SLUG基因核心启动子区的报告基因质粒,将该质粒和外源带FLAG标签的SND1表达载体转染至SKOV3细胞检测荧光值;对相同启动子区不同位置设计引物利用ChIP实验证实SND1可以富集SLUG启动子区。(2)Co-IP实验检测SND1与组蛋白乙酰转移酶及其下游修饰位点的相互作用,qChIP检测敲低SND1蛋白后,组蛋白乙酰转移酶及其修饰产物在SLUG启动子区的富集差异。实验结果:一、SND1促进卵巢癌细胞SKOV3上皮向间充质转化(EMT)过程(1)敲低SND1蛋白的SKOV3细胞形态向圆形或多边形改变,且成团分布。(2)敲低SND1蛋白抑制SKOV3细胞迁移和侵袭能力。(3)敲低SND1蛋白抑制SKOV3细胞在小鼠腹腔内的播散和生长。(4)在SKOV3细胞中敲低SND1蛋白影响细胞粘附相关基因、TGFβ及WNT等参与EMT激活信号通路分子的mRNA水平。(5)敲低SND1蛋白使上皮型蛋白CDH1恢复表达并仅聚集在胞膜上,胞浆中的CDH2下调;敲低SND1蛋白使上皮型蛋白CDH1/CLDN1表达升高,间质型蛋白CDH2/VIMENTIN表达下降。(6)在敲低SND1蛋白的SKOV3细胞株中重新恢复SND1的表达,导致上皮型蛋白CDH1/CLDN1表达降低,间质型蛋白CDH2/VIMENTIN表达升高。二、SND1通过调控SLUG表达促进SKOV3细胞EMT的发生(1)敲低SND1的SKOV3细胞株中,SLUG的mRNA和蛋白水平下降;在SND1过表达及恢复实验组中,SLUG的蛋白水平与SND1变化一致。(2)过表达SLUG后,SKOV3细胞上皮型蛋白表达降低,间质型蛋白表达升高;敲除SLUG蛋白后,上皮型蛋白表达升高,间质型蛋白表降低。(3)过表达SLUG蛋白增强SKOV3细胞迁移侵袭能力;敲除SLUG蛋白抑制SKOV3细胞迁移侵袭能力。(4)在敲低SND1蛋白的SKOV3细胞中过表达SLUG使上皮型蛋白发生先升高后降低、间质型分子先降低后升高的变化,细胞的迁移和侵袭能力随SLUG的表达升高。(5)在过表达SND1蛋白的SKOV3细胞中敲除SLUG蛋白使上皮型蛋白发生先降低后升高、间质型分子出现先升高后降低的变化,细胞的迁移和侵袭能力随SLUG的缺失而降低。三、SND1招募组蛋白乙酰转移酶促进SLUG转录(1)单独转染含有SLUG启动子区的Gluc报告基因质粒至SKOV3细胞中荧光值有所升高,当共转染FLAGSND1表达质粒与含SLUG启动子区的Gluc质粒时荧光值显著升高;SND1可以与SLUG启动子区序列结合。(2)SND1与组蛋白乙酰转移酶GCN5和p300及其下游修饰位点H3K9/H3K18存在相互结合,敲低SND1蛋白可减少GCN5和p300及其修饰位点对SLUG启动子区的富集强度。实验结论:在本研究中我们发现SLUG在SKOV3细胞系中可作为SND1蛋白的下游调控基因。SND1蛋白通过招募两种组蛋白乙酰转移酶GCN5和p300至SLUG基因的核心启动子区,增强该区域的乙酰化修饰水平从而导致染色质结构松散有利于转录的发生,使SLUG在SKOV3细胞中的表达水平明显升高,最终发挥促进EMT进程的作用。