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目的:电压门控钠通道（voltage-gated sodium channel）是可兴奋细胞中动作电位快速上升的基础,也是调节细胞内离子浓度和影响信号传导途径的关键决定因素。迄今为止,已经认识到10种哺乳动物Na V亚型可形成VGSCs超家族。其中,Na V1.2对于动作电位沿主要在神经细胞和肌肉中发现的无髓轴突的传播至关重要。钙调蛋白（CaM）是许多真核细胞信号转导途径的基本蛋白,是Ca2+结合蛋白之一。CaM以Ca2+依赖性的方式在大多数VGSCs的α亚基中识别出两个细胞内位点。CaM分子包含两个环,每个环（N或C环）都包含两个Ca2+结合位点——EF手。CaM通过IQ（异亮氨酸和谷氨酰胺）结构域与许多离子通道结合,包括VGSC和电压门控钙通道（VGCC）。所有十种VGSC同工型均包含经典CaM结合的IQ区域。Na V1.2 C末端的序列包含IQ结构域,该区域与Ca2+信号转导相关,并通过调节细胞内游离Ca2+浓度来调节反应活性。自闭症是一种遗传性疾病,大约90%的自闭症都具有遗传性,三分之一的自闭症患者会发作癫痫。自闭症易感基因座位于一组VGS基因簇附近。编码Na V1.2的基因SCN2A突变导致全身性癫痫伴高热惊厥加（GEFS+）。此外,SCN2A中的突变是自闭症谱系障碍和婴儿癫痫发作的必不可少的危险因素。已证明与野生型Na V1.2IQ域相比,Na V1.2 IQ域R1902C中的自闭症相关突变会影响CaM和Na V1.2 IQ域之间的结合。先前的研究表明Na V1.2突变体通道（R1902C）显示出持续的Na+电流增加。然而,Ca2+/CaM与Na V1.2 IQR1902C域结合的机制仍不清楚。此外,通过α-螺旋接头彼此连接的CaM组成蛋白（N-和C-环）在结构上可以进行比较。但是,C环和Ca2+之间的结合能力是N环的10-25倍。我们先前发现,在调节Na V1.1通道时,CaM的组成蛋白（N环和C环）具有环特异性。但是,尚未很好地证明Na V1.2 IQR1902C域上CaM的环特异性调节。本研究中,我们通过分子生物学方法首先检查了CaM与Na V1.2 IQR1902C域在各种Ca2+浓度下的结合,证明了CaM与Na V1.2 IQR1902C域之间的不同结合特性。我们还发现,在不同Ca2+条件下,CaM与Na V1.2 IQR1902C结构域之间的环特异性相互作用。我们的研究提供了自闭症中Ca2+/CaM调控Na V1.2 IQR1902C域的新机制,为自闭症的机制的阐明提供新的理论及实验基础。方法:1.体外结合实验通过PCR产生人Na V1.2的野生型IQ结构域的相应cDNA（1901Lys-1927Lys）。使用Quickchange TM试剂盒（QIAGEN）进行Na V1.2 IQR1902C突变体的构建,以进行定点诱变。将载体在表达与靶蛋白的融合肽的大肠杆菌BL21（DE3）中扩增为谷胱甘肽-S-转移酶（GST）。GST-IQ,CaM和CaM的叶以Bradford方法定量,以牛血清白蛋白（BSA）为标准,校正因子为:0.83（GST-IQ）,1.22（CaM）,2.74（CaM的N环）,和0.74（CaM的C环）。对于CaM结合测定,将固定的GST-IQ或其突变体（2-4μg）与各种[CaM]（0.07、0.21、0.7、1.4、2.1μM）在4℃于300μL Tris中孵育4小时。存在各种Ca2+浓度的缓冲液（pH=8.0）([Ca2+]≈free:Tris缓冲液,5m M EGTA和pH=8.0;100n M:Tris缓冲液,5m M EGTA,4.7883m M Ca Cl2和pH=8.0;500n M:Tris缓冲液,5m M EGTA,5.096m M Ca Cl2和pH=8.0;2 m M:Tris缓冲液,0.1M Ca Cl2和pH=8.0)。然后,通过使用与上述相同的洗涤缓冲液将反应混合物轻轻洗涤两次。用5x SDS-PAGE上样缓冲液洗脱结合的CaM,并溶解在15%SDS-PAGE凝胶中。2.计算机分子对接在Discovery Studio 2017中,我们使用了创建同源性模型工具从Na V1.2 IQ-CaM复合体（PDB:2KXW）导出Na V1.2的IQ母题的晶体结构。在Discovery Studio（DS）中,我们使用ZDOCK和RDOCK协议执行对接研究。在我们的案例中,ZDOCK得分越高,对接姿势应表现出更好的交互性。此后,使用CHARMM力场从ZDOCK中选择了10个最高得分姿势,以实现RDOCK协议中的能量最小化。最后,我们将分子模型图中所示的结合界面分析中的RDOCK能量最低的最高姿势（E＿RDOCK）进行了改进。ZDOCK和RDOCK程序的结合有助于更好地定义Na V1.2 IQ基序与CaM的组成蛋白（截短的N环和C环）的良好相互作用。对于图中所示的单个相互作用,对接结果显示为具有最低RDOCK相互作用能的N-/C环-IQ配合物最佳姿势的实心带。3.统计分析将Pull down实验中获得的胶图通过Image J基于分子质量将量化的灰度转换为摩尔量。使用软件Sigma Plot 12.0（版本12,Sigma-Aldrich,北京,中国）将数据拟合至理论曲线。对于C环与Na V1.2 IQwt基序之间的结合,我们选择了一个位点拟合模型,并采用了希尔方程:y=Bmax·x/（Kd+x）;对于除C环和Na V1.2 IQwt基序之间的结合以外的组合,我们选择了两个位点的模型,并选择了希尔方程:y=Bmax1·x/（Kd1+x）+Bmax2·x/（Kd2+x）（Kd:表观解离常数）。差异的统计显著性采用ANOVA评估,然后采用Tukey测试（Graph Pad Software,圣地亚哥,加利福尼亚）进行评估,并且P<0.05被认为具有统计学意义。结果:1.我们通过分子对接技术发现N环和Na V1.2 IQR1902C基序的最佳取向的ZDOCK得分和E＿RDOCK分别为11.78和-48.67 k J/mol,而C环与Na V1.2 IQR1902C基序的相互作用分别为11.72和-33.77 k J/mol。除此之外,CaM与Na V1.2 IQR1902C的最佳ZDOCK得分和E＿RDOCK为13.86和-68.36 k J/mol。2.我们通过pull-down技术发现CaM与Na V1.2 IQR1902C基序的结合特性,发现Na V1.2IQR1902C基序和CaM在500 n M[Ca2+]处具有最大结合。然而,CaM和IQwt域之间的组合呈U形,在[Ca2+]≈free时最高,而在100 n M[Ca2+]时最低。因此,与IQwt相比,CaM与IQR1902C结合的Ca2+依赖性几乎消失,在100和500 n M[Ca2+]下与IQR1902C的结合增加。3.我们通过pull-down技术发现CaM的结构域组成蛋白（截短的N环和C环）与Na V1.2 IQR1902C基序之间的结合特性,发现CaM的结构域组成蛋白N环与C环与Na V1.2 IQR1902C基序之间的结合。R1902C的突变体减弱它在特定的[Ca2+]浓度(包括≈free和2 m M[Ca2+])下与N环结合的能力。与Na V1.2 IQwt基序相比,R1902C的突变降低了与C环的结合能力。4.我们将Na V1.2 IQwt基序中的R1902突变为半胱氨酸C之后,相邻氨基酸之间容易形成二硫键,所以我们加入二硫苏糖醇（DTT）作为还原剂,进行重复实验。结果为是否加入DTT并不会影响CaM与Na V1.2 IQR1902C基序的结合。结论:1.与IQwt相比,在100和500 n M[Ca2+]下CaM与IQR1902C的结合增加。2.在IQR1902C突变体中,CaM域结合的Ca2+依赖性几乎消失。3.CaM结构域的两个组成蛋白（截短的N环和C环）都可以与IQR1902C突变体结合,并且主要与C环相互作用。4.与Na V1.2 IQwt基序相比,R1902C的突变降低与CaM的C环的结合能力。5.加入还原剂DTT后,并不会影响CaM与Na V1.2 IQR1902C基序的结合。综上所述,我们的研究揭示了IQR1902C基序（自闭症相关突变）的CaM调节的新机制,为自闭症的产生和发展机制以及联合抗癫痫/自闭症药物的作用靶点的寻找提供了新方向。