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研究背景在世界范围内,肝癌是第5大常见肿瘤,且男性肿瘤病死率居第3位。我国原发性肝癌中90%是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。早期肝细胞癌患者手术治疗后容易复发转移,1年复发率超过50%,5年生存率仅有30%。晚期肝细胞癌患者目前的缺乏有效的治疗手段。因此,寻找预测肝细胞癌患者复发和死亡风险的分子标志物对于下一步治疗尤为重要。肝细胞癌的分子分型还未建立,巴塞罗那肝癌临床分期是根据预后和治疗分配的主要临床方法。肿瘤突变总负荷(tumor mutation burden,TMB)正在成为免疫检查点抑制剂敏感性的可靠的标志物。一些研究也发现TMB在不同的恶性肿瘤中有不同的预后价值。每个肝细胞癌平均有40个基因组变异,其中很少的一些被认为是驱动变异。常见的驱动肝细胞癌发生发展五个信号通路包括细胞周期调控、WNT-β-catenin、表观遗传和染色质重塑、AKT-m TOR-MAPK和氧化应激。进一步了解影响肝细胞癌复发和死亡的关键分子标志物,可以帮助找到关键的驱动基因突变。随着测序技术的进一步完善,通过全基因组(whole genome sequencing,WGS)或全外显子组(whole exome sequencing,WES)测序找到HCC的体细胞变异,已经建立很完善基因数据库,例如TCGA(The Cancer Genome Atlas)和ICGC(International Cancer Genome Consortium)等权威数据库,基于这些公共数据库已经发表了很多高质量的文章。研究目的本研究试图通过对TCGA和ICGC等多个数据库中HCC全基因组和全外显子的二代测序结果结合东方肝胆医院收集的样本的RNA测序数据进行分析,整合多家报道,研究TMB、关键信号通路基因体细胞变异与预后的关系,发现导致HCC复发和死亡的分子标志物。研究方法1.数据来源:本研究使用TCGA数据库中376例HCC患者全外显子测序数据和基因表达的数据(m RNA)。从c Bio Portal(www.cbioportal.org)获得schulze2015队列243例的HCC患者全外显子测序数据。从ICGC(dcc.icgc.org)获得NCC-JP 394例日本队列和LICA-FR 241例法国队列的全基因组测序数据。本研究利用东方肝胆医院肝癌患者的癌和癌旁组织RNA测序数据作为验证数据来源。研究变异频率与生存指标的相关性,用生存分析研究TMB、关键信号通路基因体细胞变异与预后的关系。2.样本纳入:纳入研究数据包括含有WES或WGS等检测数据的患者基本临床信息及随访信息、基因突变和拷贝数变异的信息。3.TMB在HCC的价值分析:TMB定义为编码区域内非沉默体细胞突变的总数。将TMB数值从大到小排列,前四分位为高TMB组(TMB-H),其余的为低TMB组(TMB-L)。分析TMB和年龄、性别、分期、肝硬化、病因、血管浸润程度和分化程度的关系,探索TMB的预后预测作用。4.五大关键通路的价值分析:HCC关键五个通路,包括细胞周期调控、WNT-β-catenin、表观遗传和染色质重塑、AKT-m TOR-MAPK和氧化应激。分析五大关键通路中基因变异和HCC预后的关系。研究结果1.TCGA队列、JP队列、schulze2015队列和FR队列中,对数转换后的TMB与年龄均呈正相关(P<0.001)。同时发现,男性患者的TMB更高(P<0.05)。2.在TCGA和schulze2015队列中,HCV和HBV感染背景的患者TMB最高,且有两个或以上混合病因的患者中TMB-H的患者占比最多。同时在这2个队列中发现,无肝硬化的患者比有肝硬化的患者TMB更低(P<0.05)。3.在schulze2015队列中,对数转换后的TMB与肿瘤大小呈正相关(r=0.204,P=0.002)。但是,在4个队列中,TMB和临床分期均没有关联。4.在TCGA队列中亚洲人的细胞周期调控通路基因变异高于TCGA队列中的白种人和FR法国人队列。同时也发现,HBV和HCV背景患者细胞周期调控通路基因变异更高(P=0.005)。5.TCGA队列中,与低TMB组比较,高TMB组HCC患者的OS(P<0.001)及DFS(P=0.088)均明显降低,高TMB组HCC患者的死亡风险是低TMB组的2.156倍(P<0.001)。6.TCGA队列、JP队列和FR队列中,细胞周期调控通路基因变异的HCC患者中位DFS和中位OS均低于无变异的患者(P<0.05),而复发风险和死亡风险均高于无变异患者(P<0.05)。同时,在TCGA队列和东方肝胆的数据队列中,我们也发现细胞周期调控基因表达水平高的患者相较表达水平低的患者DFS和OS更差。研究结论1.HCC患者的TMB频率增加与年龄、男性、和肿瘤直径有关。2.有HBV或HCV感染背景的患者TMB更高,且细胞周期调控通路基因变异更多。3.肿瘤突变负荷高和细胞周期调控通路的基因变异的HCC患者预后较差。