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背景:原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,淋巴道转移是其早期重要转移途径,是造成肝癌高复发和预后差的主要因素之一。Hca-P细胞株的淋巴结转移率<30%,而Hca-F细胞株的淋巴结转移率>70%,它们是本课题组前期利用可移植性小鼠肝癌腹水细胞筛选得到,来源于同一遗传背景、同一亲本细胞的不同淋巴道转移潜能的肝癌细胞株。苹果酸脱氢酶2是一种存在于细胞线粒体中的氧化还原酶,参与三羧酸循环,氨基酸合成等多种重要代谢途径,它在肿瘤的发生发展、迁移和侵袭中起重要作用。研究发现Hca-P细胞中苹果酸脱氢酶2的蛋白表达水平高于Hca-F细胞。膜联蛋白A7在Hca-F细胞中的基因和蛋白的表达水平均高于Hca-P细胞,其表达水平与肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力成正比。因此,研究苹果酸脱氢酶2与膜联蛋白A7之间的相互作用关系有助于进一步探讨它们在肿瘤中的作用机制。目的:1.研究苹果酸脱氢酶2对Hca-P细胞增殖凋亡、迁移侵袭能力的影响。2.在体内外研究苹果酸脱氢酶2与膜联蛋白A7的相互作用关系。方法:一、苹果酸脱氢酶2对小鼠肝癌Hca-P细胞增殖凋亡,迁移及侵袭能力的影响1.分别构建苹果酸脱氢酶2上调(pmu)和下调(pmd)质粒表达载体、膜联蛋白A7上调(pa7u)和下调(pa7d)质粒表达载体,和其对应的阴性对照(pun、pdn),稳定转染至Hca-P细胞。应用q RT-PCR和western blot检测构建是否成功。2.应用CCK-8法检测苹果酸脱氢酶2上下调对Hca-P细胞增殖能力的影响。3.应用流式细胞术检测苹果酸脱氢酶2上下调对Hca-P细胞凋亡能力的影响。4.应用Transwell法检测苹果酸脱氢酶2上下调对Hca-P细胞迁移侵袭能力的影响。二、体内外研究苹果酸脱氢酶2与膜联蛋白A7的相互作用关系1.使用免疫共沉淀法检测苹果酸脱氢酶2与膜联蛋白A7是否相互作用。2.建立小鼠肝癌Hca-P细胞动物模型。3.应用q RT-PCR、western blot、免疫细胞化学和免疫组织化学体内外检测苹果酸脱氢酶2和膜联蛋白A7的m RNA和蛋白表达水平。结果:一、苹果酸脱氢酶2对小鼠肝癌Hca-P细胞增殖凋亡,迁移及侵袭能力的影响1.q RT-PCR和western blot实验显示:苹果酸脱氢酶2在MDH2上调(pmu)细胞组的m RNA和蛋白表达水平明显高于正常组(p组)和对照组(pun组),苹果酸脱氢酶2在MDH2下调(pmd)细胞组的m RNA和蛋白表达水平明显低于正常组(p组)和对照组(pdn组)(P<0.05);而p组和pun组以及p组和pdn组之间无明显统计学差异(P>0.05)。2.CCK-8增殖实验结果显示:p组、pun组和pmu组的细胞数量在24h无明显差异,自48h起开始有显著差异,且每个时间点均有统计学意义(P<0.05),p组、pmd组和pdn组也是如此。其中48h后pmu组细胞的增殖能力一直低于p组和pun组;pmd组细胞增殖能力始终高于p组和pdn组。3.流式细胞术结果显示:pmu组细胞早期凋亡率高于p组和pun组,pmd组细胞早期凋亡率明显低于p组和pdn组(P<0.05)。4.Transwell实验结果显示:不论迁移实验还是侵袭实验,pmu细胞组穿过小室的细胞数目明显少于p组和pun组,pmd细胞组穿过小室的细胞数目明显多于p组和pdn组,差异具有统计学意义(P<0.05)。二、体内外研究苹果酸脱氢酶2与膜联蛋白A7的相互作用关系1.免疫共沉淀结果显示:苹果酸脱氢酶2与膜联蛋白A7为相互作用蛋白。2.q RT-PCR、western blot、免疫细胞化学和免疫组化结果显示:苹果酸脱氢酶2在pa7u组的m RNA和蛋白表达水平明显低于p组和pun组,在pa7d组的m RNA和蛋白表达水平显著高于p组和pdn组(P<0.05)。膜联蛋白A7在pmu组的m RNA表达水平明显高于p组和pun组,在pmd组的m RNA表达水平明显低于p组和pdn组(P<0.05);然而膜联蛋白A7在pmu组的蛋白表达水平低于p组和pun组,在pmd组的蛋白表达水平明显高于p组和pdn组(P<0.05)。体内外实验结果均一致。结论:1.苹果酸脱氢酶2可抑制小鼠肝癌Hca-P细胞的增殖、迁移和侵袭能力,增强细胞凋亡能力。2.苹果酸脱氢酶2与膜联蛋白A7在小鼠肝癌Hca-P细胞中为相互作用蛋白,可能共同参与调控肿瘤的发生与发展进程。