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食管癌是消化道最常见的恶性肿瘤，其发病率为13／10万，每年新增患者超过30万人，并且大多数发生于发展中国家，在我国食管癌（esophageal cancer，EC）每年新增诊断病例约25万，尤以我国北方太行山区发病率最高。死亡率为男性27.54／10万，女性14.05／10万，居癌症死因第4位，是威胁人民身体健康的消化道恶性肿瘤之一。食管癌主要有鳞癌（squamous cell carcinoma，SCC）和腺癌（adenocarcinoma，ADC）两种组织形式，它们的病因学和病理学特征有很大不同，我国食管癌占恶性肿瘤发病率的第四位，并且以鳞癌为主。围手术期常辅以放疗，如何提高食管磷状癌细胞对放射线的敏感性，既能按计划量照射，又能降低放疗对正常组织的损伤，一直是我们追求的目标。研究显示癌细胞凋亡增加，有更大的放射敏感性，有学者将肿瘤细胞凋亡水平作为肿瘤放射敏感性的衡量指标。很多学者都致力于探索增加细胞凋亡的方法，以期提高细胞对放射线的敏感性。处于分裂周期不同时相的细胞其放射敏感性有很大的差异。放射生物学研究已证实，细胞周期中不同时相的细胞放射敏感性有很大差别，G2后期和M期放射敏感性最高。因此，促使肿瘤G1／S期细胞进人并停留在对放射线敏感的G2／M期，是提高肿瘤放射敏感性、改善疗效的一个重要途径。放射增敏剂是指能提高射线对癌细胞的杀伤力，而对受照射的正常细胞影响不大的一些物质（化学合成药物、中草药及其有效成分、生物制品等）。从20世纪60年代初期，国内外对放射增敏剂进行了长期的研究，多种化学药物曾被尝试用作放射增敏剂，然而临床效果不理想，并且普遍存在骨髓抑制等毒副反应，如5-氟尿嘧啶是放疗常用的化学增敏剂，但毒副反应明显，常出现胃肠道反应。因此研究探索新的高效低毒增敏剂具有实用价值，我国中草药资源十分丰富，而且蕴涵较大的研发潜力。β—榄香烯乳是从中药莪术中提取出来的具有抗癌活性的国家二类抗癌新药，对正常细胞及组织毒性非常低，副作用轻微，无明显肝、肾功能损害，不发生骨髓抑制，不同于一般的细胞毒性化疗药物。多项研究表明β—榄香烯乳对诸多肿瘤有抗癌效应，下调bcl-2基因表达、诱导细胞凋亡、改变细胞周期分布是其主要抗癌机制。已有研究证明其可增加癌细胞对放射线的敏感性。本研究用低细胞毒性浓度β—榄香烯乳作用肿瘤细胞后，观察榄香烯乳对食管磷状癌细胞体外放射增敏作用，并探讨其增敏机制，为临床研究提供新思路和借鉴，为中药放射增敏研究提供方法。目的：本课题旨在研究β—榄香烯乳对人食管鳞状癌细胞放射敏感性的影响，并探讨其相关机制，着重解决以下问题：1、β—榄香烯乳是否增加人食管鳞状癌细胞的放射敏感性及不同浓度—时间作用后的增敏效果如何。2、探讨β—榄香烯乳放射增敏的机制。材料与方法：食管鳞状癌细胞株（EC109）由郑州大学医学院病理生理教研室保存，β—榄香烯乳由大连金港制药集团有限责任公司生产，EC109细胞培养于RPMI-1640培养基中。实验组用含不同浓度（20μg／mL、40μg／mL、60μg／mL、80μg／mL、120μg／mL）β—榄香烯乳培养基进行培养，设β—榄香烯乳空白对照组，然后在不同的照射剂量下照射（0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy）。细胞在实验设定的时间终止培养，用MTT法和集落形成法测定不同浓度β-榄香烯乳对细胞生长的抑制率；MTT法初步判断其对EE109细胞的放射敏感性；集落形成法观察β-榄香烯乳对EC109细胞的放射增敏作用；流式细胞术分析β-榄香烯乳作用前后细胞周期及凋亡变化；间接免疫荧光联合流式细胞仪定量检测凋亡调控蛋白BC1-2、Bax的表达变化；免疫细胞化学染色观察Bcl-2、Bax蛋白表达变化。数据采用Spss10.0统计软件进行统计学分析，采用单因素方差分析、t检验和趋势卡方检验进行统计学分析，多重比较采用Dunnett法、检验水准α为0.05。结果：1．β-榄香烯乳作用细胞24h后，低浓度20μg／mL反而促进细胞增殖，40μg／mL以上浓度，随β-榄香烯乳浓度增加，细胞生长抑制率增加（P＜0.05）。2．不同照射量照射经0μg／mL、40μg／mLβ-榄香烯乳作用24h后的细胞，测OD值，结果40μg／mL组OD值均较空白组OD值减小。经0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy照射后OD值从0.907±0.053、0.838±0.027、0.774±0.029、0.680±0.013、0.652±0.013分别降至0.800±0.009、0.680±0.009、0.562±0.009、0.454±0.009、0.345±0.009，统计学分析两组间有显著性差异（P＜0.05）。初步判断β-榄香烯乳对EC109细胞有放射增敏作用。3．不同照射剂量照射经40μg／mL、60μg／mLβ-榄香烯乳作用24小时后的细胞集落结果及存活率，与空白组比较均有显著性差异（P＜0.05）。40μg／mL、60μg／mL两浓度组之间也有显著性差异（P＜0.05）。经0Gy、2Gy、4Gy、、6Gy、8Gy照射后细胞集落数从88±2.65、74±2.65、55±2.65、48±3.61、38±3.46分别减少至40μg／mL组78±2.00、60±3.61、49±1.00、31±1.00及60μg／mL组71±2.65、53±1.73、43±2.65、25±5.00、13±3.61。集落形成法进一步证明：β-榄香烯乳在低细胞毒性浓度下对EC109细胞有放射增敏作用，随浓度增加，放射增敏作用增强。4．不同照射剂量照射经60μg／mLβ-榄香烯乳作用48h后的细胞集落结果及存活率与60μg／mL作用24h有显著性差异（P＜0.05）。经0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy照射后集落数从88±2.65、74±2.65、55±2.65、48±3.61、38±3.46分别减少至24h组78±2.00、60±3.61、49±1.00、39±2.65、31±1.00及48h组74±1.00、53±1.00、36±4.58、20±6.08、8±6.46。β-榄香烯乳在低细胞毒性浓度下对EC109细胞有放射增敏作用，随作用时间增加，放射增敏作用增强。5．随β-榄香烯乳浓度、作用时间的增加，EC109细胞的凋亡率有上升趋势，由开始的0.1％升高到17.6％。统计学分析组间有显著性差异（P＜0.05）β-榄香烯乳作用后细胞凋亡率增加与浓度、作用时间成正相关。6．β-榄香烯乳作用细胞后发生G2／M期阻滞，相同时间下，药物浓度越高，G2／M期细胞比率越高，有上升趋势。统计学分析组间有显著性差异（P＜0.05）。7．60μg／mLβ-榄香烯乳作用24h，细胞Bcl-2表达下降，着色减弱；定量结果显示：相同时间，不同浓度β-榄香烯乳作用后，随药物浓度增加Bcl-2蛋白平均荧光强度减少（P＜0.05）；同一药物浓度，不同作用时间，随作用时间增加，Bcl-2平均荧光强度也减少（P＜0.05）。8．60μg／mLβ-榄香烯乳作用24h，细胞Bax表达增加，细胞浆着色增强；定量结果显示：相同时间，不同浓度β-榄香烯乳作用后，随药物浓度增加Bax蛋白表达增加（P＜0．05）；同一药物浓度，不同作用时间，随作用时间增加，Bcl-2蛋白表达也增加（P＜0.05）。结论：1．40μg／mL～120μg／mLβ-榄香烯乳对EC109细胞有抑制作用，可阻滞细胞于G2／M期，与浓度成正相关，随浓度增加，细胞生长抑制率增加。2．β-榄香烯乳在低细胞毒性浓度下对EC109细胞有放射增敏作用，且具有剂量和时间依赖性，并随浓度的增加和时间延长，放射增敏作用增强。3．β-榄香烯乳可调控抗凋亡基因bcl-2，蛋白表达与浓度、作用时间成负相关。4．β-榄香烯乳可调控凋亡基因bax，蛋白表达和细胞凋亡率与浓度、作用时间成正相关。