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目的:基于文献挖掘技术,分析汇总糖尿病(Diabetic Mellitus,DM)代谢组学差异代谢物相关信息和生物学意义,并挖掘出其中可能具有潜在重要影响的关键差异代谢物;利用分子生物学,网络药理学以及文献挖掘等多种手段分析关键差异代谢物作用于高糖诱导的大鼠视网膜微血管内皮细胞(Retinal microvascular endothelial cells,RMECs)损伤变化情况,探讨差异代谢物的作用机制,为糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)的诊断和治疗提供新靶点以及多角度的临床监测指标。方法:1.对近年来糖尿病代谢组学相关的文献进行检索,将汇总到的代谢物进行了筛选和频次分析,选取出频次≥2的代谢物作为后续研究对象,并进行了通路富集分析,得到所占比重最高的代谢通路,并从通路上筛选出关键的差异代谢物。2.利用高糖诱导的大鼠视网膜微血管内皮细胞模型评估差异代谢物对细胞活力的影响情况,再从细胞迁移能力等角度考察差异代谢物诱导微血管内皮细胞功能损伤情况。3.通过细胞超氧化物歧化酶(SOD)含量、丙二醛(MDA)含量、细胞活性氧(ROS)水平及细胞凋亡情况的变化评估差异代谢物诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞高糖模型的氧化损伤情况。4.结合网络药理学技术,分析“成分-靶点-疾病-通路”的情况,分别将差异代谢物与糖尿病视网膜病变靶点进行关联分析,并进行蛋白互作,得到与两种差异代谢物关联密切的信号通路信息,为后续的机制研究提供一定的依据,再通过Western Blot技术验证晚期糖基化终末端产物受体-激酶2/信号转导和转录激活因子3通路(RAGE-JAK2/STAT3)相关蛋白的表达情况,分析差异代谢物与RAGE-JAK2/STAT3通路之间的关联,进一步明确差异代谢物的损伤作用机制。结果:1.利用文献挖掘技术筛选出大鼠糖尿病代谢组学相关的文献,得到差异代谢物频次≥ 2的代谢物32个,对这32种差异代谢物进行通路富集分析发现脂质代谢通路上涉及的代谢物有15个,占比最多,占48.39%;糖代谢通路涉及的差异代谢物共10个,占比32.26%;参与氨基酸代谢通路的差异代谢物占比35.48%。根据MetPA分析结果发现,鞘脂代谢是影响力排名第一的代谢通路,参与脂质代谢的代谢物有二氢鞘氨醇、丝氨酸、1-磷酸鞘氨醇和鞘氨醇等五种,其中,代谢物水平上调的只有二氢鞘氨醇、丝氨酸和1-磷酸鞘氨醇,因此这三种差异代谢物作为后续实验的研究对象。2.通过细胞活力实验,我们发现二氢鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇均能加重高糖诱导的大鼠视网膜微血管内皮细胞的损伤,而给予了较大剂量的(浓度为1 mM)丝氨酸后,并未对高糖诱导的大鼠视网膜微血管内皮细胞造成显著性的损伤;我们又进行了二氢鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇对微血管内皮细胞迁移能力影响的实验研究,发现两种鞘氨醇类代谢物会抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移,以上实验说明了二氢鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇会加剧高糖诱导的大鼠视网膜微血管内皮细胞模型的损伤。3.通过检测细胞SOD及MDA等生化指标,发现与高糖组相比,二氢鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇诱导的大鼠视网膜微血管内皮细胞高糖模型中SOD活力值显著性下调,MDA水平明显上升,说明二者均会诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞氧化损伤、细胞凋亡和ROS水平的升高,给予代谢物刺激的大鼠视网膜微血管内皮细胞高糖模型的细胞凋亡率上升,活性氧水平也明显增加,进一步验证了二氢鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇的确会对大鼠视网膜微血管内皮细胞的高糖模型造成氧化损伤,为后续的机制研究指明了方向。4.利用网络药理学技术进行“成分-疾病-通路”蛋白互作,对二氢鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇两种代谢物进行分析,最终得到两种代谢物与糖尿病视网膜病变的相关代谢通路,其中关联性最强的是AGE-RAGE信号通路,结合KEGG数据库信息,发现AGE-RAGE信号通路是一条与糖尿病并发症密切相关的信号通路,在网络药理学研究中,我们发现在通路富集排名前十的通路中,JAK-STAT通路作为AGE-RAGE通路的下游信号,其与细胞的信号转导密切相关,并且有研究发现,高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤与JAK2-STAT3信号通路密切相关,基于此,我们利用Western Blot技术对两种鞘氨醇类代谢物刺激高糖诱导的大鼠视网膜微血管内皮细胞模型中RAGE-JAK2/STAT3信号通路的蛋白表达情况进行了实验验证。结果显示,两种鞘氨醇类代谢物均能上调RAGE、JAK2和STAT3三种蛋白的表达情况。两种鞘氨醇类差异代谢物可能通过激活RAGE-JAK2/STAT3信号通路来诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞的损伤。结论:1.二氢鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇作为鞘脂代谢通路上的两个差异代谢物可加剧高糖诱导的大鼠视网膜微血管内皮细胞的损伤作用,降低细胞活力,抑制细胞的迁移能力,并且会造成视网膜内皮细胞的氧化损伤。2.二氢鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇可能通过激活RAGE-JAK2/STAT3信号通路诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞的ROS水平增加以及细胞凋亡等一系列的氧化应激损伤,通过研究糖尿病代谢组学差异代谢物的分子生物学机制,为糖尿病视网膜病变的诊断和治疗提供新的靶点以及为更全面的完善临床检测指标提供实验数据。