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作为一种新型低热量功能性甜味剂,D-塔格糖具有许多重要的生理功能,降血糖、改善肠道菌群、抗龋齿、促进血液健康、增强细胞对毒素的敏感性等。它的甜度是蔗糖的92%,能量远低于传统的甜味剂,具有良好的应用前景,能够应用在食品、饮料、肉制品、糖类等众多工业中。通过生物法生产D-塔格糖,L-阿拉伯糖异构酶(LAI)是目前最有效的酶,以D-半乳糖为底物。D-半乳糖可以通过β-半乳糖糖苷酶水解廉价乳糖来生产同时产生等摩尔的D-葡萄糖。在本课题研究中,联合β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖异构酶以廉价的乳糖为底物来转化生产D-塔格糖。本研究首先比较用来固定β-半乳糖苷酶的氨基化硅胶不同制作方法,得到了最佳的氨基化硅胶制作工艺。对β-半乳糖苷酶的固定方法进行了优化:2%戊二醛交联3 h,固定pH 6.0,温度30 ℃过夜,固定载体(g)与酶(U)的比例为1:1000(g:U)。酶在最佳条件下固定化,酶活回收率达到60%。固定酶的最适反应条件:温度55 ℃,pH5.0。在此最佳条件下,固定酶的酶活性达到了 560±10 U/g。固定化酶经10个批次反应,酶活性仅略有下降,表现出良好的重复利用性,适合应用于工业化生产。水解反应2 h后,乳糖水解率达到95%以上,为后续生产D-塔格糖提供了原料。对Lactobacillus.fermetum CGMCC 2921中的L-阿拉伯糖异构酶基因(araA)(GenBank:HM150718.1)进行了合成、克隆,构建了重组质粒pET-22b-araA并将其成功转化到了大肠杆菌Escherichiacoli BL21-GroEL-GroES(DE3)中。用1 mMIPTG、25 ℃诱导重组菌 E.coli BL21(DE3)(pET-22b-araA)。超声破碎菌液以获得游离酶,游离酶的最佳反应条件为:温度60℃,pH 8.0。酶的耐热性良好,并且pH 7.0-9.0的碱性条件下耐碱性好。1 mM的Mn2+对游离酶活性有显著影响。氨基树脂SQ-100EA对L-阿拉伯糖异构酶粗酶液的固定化效果最好。优化酶的固定条件:1.0%戊二醛固定3 h,固定温度25 ℃,固定pH 7,载体与粗酶液的比例为1:130(g:U)。通过实验发现,在固定期间添加1 mM的Mn2+不仅增加了固定化酶的酶活性,而且大大增加了固定化酶的耐热性。固定化酶的最适反应条件为:60℃,pH7.5。在最佳条件下,固定化酶的酶活性达到49±2U/g,酶活回收率接近40%。另外,固定酶的热稳定性和pH稳定性显著提高。固定酶以D-半乳糖为底物的转化实验中,2hD-塔格糖的转化率达到12%,48 hD-塔格糖的转化率达到23%。