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第一部分 BMP-2小分子活性多肽P28体外诱导MC3T3-E1细胞增殖及成骨分化能力的评价目的 通过比较P28和rhBMP-2对小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1增殖及成骨分化活力的影响,评价P28发挥诱导成骨分化的能力。方法 分别使用P28或rhBMP-2对MC3T3-E1细胞进行干预,不添加任何生长因子的 ·空白组作为对照,培养1、3、5天后使用钙黄绿素对细胞进行染色,荧光显微镜观察各组细胞活力及增殖趋势;培养1、3、5、7天后采用MTT法检测各组细胞的增殖活力;培养7、14天后使用ALP染色液对细胞进行染色,显微镜下定性观察各组细胞ALP活性,同时采用ALP定量检测试剂盒定量评价各组细胞ALP活性;培养14、21天后使用茜素红染色液对钙结节进行染色,显微镜下观察各组细胞钙结节生成情况;培养1、3、7天后,Real-Time PCR检测Runx2、OCN、ColⅠ基因的表达情况,Western blot检测Runx2、p-Smad1/5/8、OCN、ColⅠ蛋白表达量,观察各组细胞成骨分化活性。结果钙黄绿素染色后在荧光显微镜下观察结果和MTT法检测结果显示P28组和rhBMP-2组细胞活力和增殖趋势明显高于空白组,差异有统计学意义(p<0.05),P28组与rhBMP-2组之间无显著差异(p>0.05);ALP染色和ALP定量检测结果显示P28组和rhBMP-2组细胞ALP活性明显高于空白组,差异有统计学意义(P<0.05),P28组与rhBMP-2组之间无显著差异(P>0.05);茜素红染液钙结节染色结果显示P28组和rhBMP-2组的钙结节明显多于空白组,P28组与rhBMP-2组之间无明显区别;Real-Time PCR检测和Western blot检测结果显示P28组与rhBMP-2组较空白组相比,成骨分化相关基因Runx2、OCN、ColⅠ表达明显增高,成骨分化相关蛋白Runx2、p-Smad1/5/8、OCN、ColⅠ表达量明显增高,rhBMP-2组略高于P28组,但无显著统计学差异。结论P28可以通过BMP-2信号通路中的Smad信号通路来实现对MC3T3-E1细胞增殖和成骨分化的促进与调控,同时P28具有与rhBMP-2接近的诱导成骨分化的良好生物活性。第二部分 煅烧骨/介孔二氧化硅纳米颗粒/P28复合材料的制备、理化性质及其体外控释的实验研究目的 探讨煅烧骨/介孔二氧化硅纳米颗粒/P28复合材料的制备方法及理化性质,并评价其体外释放动力学。方法 制备介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN),采用透射电子显微镜(TEM)、Brunauer-Emmett-Teller(BET)法及 Barrett-Joyner-Halenda(BJH)法对制备的 MSN进行鉴定;按照不同的P28:MSN质量比例(1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4)确定P28与MSN之间适宜的投药比例;制备煅烧骨(TBC)和TBC/MSN支架材料,通过三维视频显微镜、场发射扫描电子显微镜(SEM)及能谱仪对两种材料的理化性质进行比较,以确定MSN是否能够良好的与TBC材料复合;用TBC和TBC/MSN两种材料分别负载3 mg P28,计算TBC/P28和TBC/MSN/P28两种复合材料所能负载的P28量,随后将两种复合材料置于恒温水浴摇床,按照第1、2、3、5、7、10、12、14、18、21和30天的时间点提取释放液测量P28释放量,比较两种支架材料负载P28的体外释放对力学。结果 制备的MSN粒径主要分布在180 ±30 nm,比表面积高达702.7 m2/g,表面孔径主要为4 nm,孔容积为0.8 cm3/g,具有良好的介孔结构和充足的载药空间;选取质量比为P28:MSN = 1:3作为较为适宜的投药比例进行药物负载,包封率达到81.88±4.44%;TBC和TBC/MSN材料的三维视频显微镜、SEM及能谱结果显示MSN较为理想的附着在TBC材料内部,分布较为均匀,并且不会对TBC良好的孔隙结构产生较大的影响;TBC/P28和TBC/MSN/P28两种复合材料对P28的负载量分别可以达到80%和98%左右,同时TBC/MSN/P28较TBC/P28释放更为缓慢和持久(p<0.05)。结论 MSN可以作为P28良好的载体材料,并且可以较为理想的与TBC支架材料相结合,并在体外环境实现对P28的长期、缓慢的释放。第三部分 煅烧骨/介孔二氧化硅纳米颗粒负载P28体外诱导MC3T3-E1细胞粘附、增殖及成骨分化的实验研究目的 通过比较 MC3T3-E1 细胞在 TBC、TBC/MSN、TBC/P28 和 TBC/MSN/P28四组材料上的粘附、增殖以及成骨分化情况,评价TBC/MSN/P28对MC3T3-E1细胞发挥诱导成骨分化的能力。方法 TBC和TBC/MSN两种材料分别负载2 mg P28,然后将实验分为TBC组、TBC/MSN组、TBC/P28组和TBC/MSN/P28组,将MC3T3-E1细胞分别种植在四组材料上,培养24小时后通过间接的细胞计数法检测四组材料上的细胞粘附率;培养3天后使用钙黄绿素和碘化丙啶对细胞染色,通过激光共聚焦显微镜观察四组材料上细胞的活力及分布趋势;培养2、4、6、8天后通过MTT法检测各组材料上细胞的增殖活力;培养5、10、15天后采用ALP定量检测试剂盒检测四组材料上细胞向成骨细胞分化的情况。结果 MC3T3-E1细胞在TBC/P28组和TBC/MSN/P28组的粘附率要明显高于TBC组和TBC/MSN组,差异有统计学意义(p<0.05),TBC/P28组与TBC/MSN/P28组间无显著统计学意义(p>0.05);钙黄绿素和碘化丙啶染色后通过激光共聚焦显微镜观察显示TBC/P28组和TBC/MSN/P28组支架材料上的细胞数量明显多于TBC组和TBC/MSN组;MTT法检测结果显示整个培养周期中TBC/P28组和TBC/MSN/P28组的细胞数量明显高于TBC组和TBC/MSN组,差异具有统计学意义(P<0.05),当培养第6和8天时,TBC/MSN/P28组细胞数量开始高于TBC/P28组,差异具有统计学差异(p<0.05);ALP定量检测试剂盒检测结果显示整个培养周期中TBC/P28组和TBC/MSN/P28组的ALP活性均明显高于TBC组和TBC/MSN组,差异具有统计学意义(p<0.05),培养第15天时,TBC/MSN/P28组明显高于TBC/P28组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 四组材料均具有良好的生物相容性,TBC/P28和TBC/MSN/P28相比TBC和TBC/MSN进一步表现出了对细胞的趋化、促进增殖和分化的能力。TBC/MSN/P28复合材料所具备的缓释性能可以更好地促进P28发挥成骨诱导活性。第四部分 煅烧骨/介孔二氧化硅纳米颗粒负载P28修复兔桡骨临界性骨缺损能力的实验研究目的 评价 TBC/MSN/P28复合材料修复兔桡骨临界性骨缺损的能力,进一步探讨该复合材料在体内环境修复大范围骨缺损的能力。方法 TBC和TBC/MSN两种材料分别负载7.5 mg P28,然后将实验分为四组:TBC、TBC/MSN、TBC/P28和TBC/MSN/P28,20新西兰大白兔随机分为4组,制备双侧桡骨中段15 mm临界性骨缺损,并分别植入上述材料。术后6周和12周,各组均随机取材5个桡骨标本,行大体观、X线检查、CT三维重建观察缺损愈合情况,随后行组织学切片HE、Masson染色,观察新生骨组织生长情况,并借助Image-Pro Plus v6.0对新生骨组织量化,进一步评价骨缺损修复情况。结果大体观、X线检查及CT三维重建结果显示TBC组6周时材料形状清楚,无明显骨痂生成,12周时材料有所降解,仍无明显骨痂形成,材料与宿主骨间无明显融合;TBC/MSN组6周和12周所见与TBC组相似;TBC/P28组6周时材料密度有所增高,材料与宿主骨间可见少量新生骨组织生成,12周时材料形状消失,表面有大量骨痂包裹,材料与宿主骨间有新生骨组织连接,缺损区基本消失;TBC/MSN/P28组6周时材料密度增高,表面有少量骨挪包裹,与宿主骨间有新生骨组织形成,12周时材料完全被骨痂包裹,与宿主骨间大量新生骨组织连接,融合良好,缺损区完全消失。组织学切片HE及Masson染色可见TBC组6周时无新生骨组织形成,12周时仅有极少量新生骨组织生产;TBC/MSN组所见与TBC组相似;TBC/P28组和TBC/MSN/P28组6周已有大量新生骨组织生成,明显多于TBC/MSN组和TBC组12周所见,12周时新生骨组织继续增多并充满材料孔隙内部,骨组织较6周时进一步成熟。TBC/P28组和TBC/MSN/P28组明显高于TBC/MSN组和TBC组,有显著统计学差异(p<0.05),6周时TBC/MSN/P28组与TBC/P28组无明显统计学差异(p>0.05),但12周时TBC/MSN/P28组高于TBC/P28组,有显著统计学差异(p<0.05)。结论TBC/MSN/P28复合材料能够缓慢释放具有骨诱导活性的生长因子P28,发挥稳定长效的成骨作用,是一种较为理想的骨组织工程修复材料。