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目的:探讨突变体p53促进子宫内膜癌上皮间充质转化(EMT)的分子机制。内容:检测突变体p53和EZH2在子宫内膜癌组织中表达并分析二者相互关系和EZH2与临床病理参数之间关系,探讨突变体p53与EZH2之间互相调控关系及分子机制,评估miR-26a对TP53突变细胞生物学行为影响,检测患者血清中miR-26a表达并分析与患者预后关系。方法:用免疫组化、Western blot、细胞免疫荧光检测蛋白表达,用qRT-PCR检测miRNA和miRNA表达,用siRNA和shRNA沉默基因表达,用过表达质粒和慢病毒上调基因表达,用ChIP-PCR和RNA-ChIP检测蛋白质与核酸相互作用,用CO-IP检测蛋白质与蛋白质相互作用,用荧光素酶报告质粒验证miRNA下游靶基因,用Transwell实验分析细胞迁移及侵袭能力改变。结果:与I型子宫内膜癌相比,EZH2与p53均高表达于II型子宫内膜癌中,且二者间存在显著正相关,EZH2高表达提示临床分期晚、深肌层浸润、病理分级高和淋巴结转移。沉默突变型p53发现EZH2蛋白表达出现显著降低,但其mRNA表达水平无明显改变。突变型p53通过抑制miR-26a表达在转录后水平调控EZH2蛋白表达。机制为p53突变一方面失去与miR-26a-1启动子区域结合而失去对其转录激活作用,另一方面通过干扰Drosha-p68复合体组装,削弱对pri-miR-26a-1剪切,二者共同降低miR-26a成熟体表达量。EZH2是miR-26a下游直接调控靶标。外源性miR-26a转入显著抑制p53突变HEC-1B细胞的迁移和侵袭能力,同时逆转其EMT转化。体内实验发现miR-26a能有效降低TP53突变的HEC-1B细胞成瘤能力。体内外实验共同证实了miR-26a能有效上调E-cadherin表达,而抑制N-cadherin、Vimentin、Snail表达。此外体内实验也证实了miR-26a负性调控EZH2蛋白表达。miR-26a在II型内膜癌患者血清中显著低表达,且与预后不良相关。结论:TP53突变通过突变体p53/miR-26a/EZH2调控轴促进子宫内膜癌细胞上皮间充质转化,进而增加子宫内膜癌细胞侵袭能力,miR-26a不仅可能成为治疗p53突变“高危型”内膜癌靶标还可能成为判断子宫内膜癌预后标志物。第一部分EZH2与突变体p53在子宫内膜癌组织中的表达及意义目的:分析EZH2在子宫内膜癌组织中的表达与子宫内膜癌临床病理参数的关系以及与p53表达相关性。方法:应用免疫组织化学方法半定量检测子宫内膜腺癌组织中EZH2和p53蛋白表达。结果:(1)与I型子宫内膜癌相比,EZH2与p53在II型子宫内膜癌组织中均高表达(P<0.001)。(2)EZH2与p53表达呈显著正相关(Spearman correlation r=0.739)。(3)EZH2高表达提示临床分期晚(P<0.001)、深肌层浸润(P<0.023)、病理分级高(P<0.001)及淋巴结转移(P=0.002)。结论:EZH2与p53均在II型子宫内膜癌组织中高表达,且二者间存在显著正相关;EZH2高表达与子宫内膜癌进展相关。第二部分突变体p53通过下调miR-26a促进EZH2表达目的:选用TP53野生型与突变型不同子宫内膜癌细胞株,探索突变体p53与EZH2表达相关性及调控关系。方法:应用蛋白印记(Western blot)方法检测子宫内膜癌细胞株中EZH2与p53蛋白的表达;分别使用EZH2 siRNA、TP53 siRNA及阴性对照分别瞬时转染HEC-1B和KLE细胞,分别应用q RT-PCR方法和Western blot方法检测EZH2和p53 mRNA和蛋白的表达;应用在线生物信息学软件(Target Scan)预测可能调控EZH2表达的miRNA,应用q RT-PCR筛选突变体p53可能抑制的miRNA;分别使用miR-26a mimics、miR-26a inhibitors(anti-miR-26a)及阴性对照瞬时转染HEC-1B和Ishikawa细胞,分别检测转染前后EZH2 mRNA和蛋白表达变化。结果:(1)与SPEC-2和Ishikawa细胞相比,EZH2在AN3CA和TP53突变的HEC-1B和KLE细胞中高表达(P<0.001)。(2)沉默EZH2后突变体p53 mRNA及蛋白均无明显改变(P>0.05)。(3)沉默突变体p53后EZH2蛋白出现明显降低(P<0.05)但其mRNA无改变(P>0.05)。(4)沉默突变体p53显著增加HEC-1B和KLE细胞中miR-26a表达(P<0.05)。(5)miR-26a mimics转入HEC-1B细胞抑制EZH2蛋白表达,anti-miR-26a转入Ishikawa细胞增加EZH2蛋白表达,均不影响mRNA水平改变。结论:突变体p53可能通过抑制miR-26a促进EZH2蛋白表达第三部分突变体p53通过下调miR-26a促进EZH2表达分子机制目的:探索突变体p53下调miR-26a分子机制以及EZH2是miR-26a直接调控靶标验证。方法:分别使用TP53 siRNA及阴性对照分别瞬时转染HEC-1B细胞,应用q RT-PCR检测转染前后pre-miR-26a-1、pre-miR-26a-2表达变化;应用Ch IP-PCR方法检测突变体p53、野生型p53与miR-26a-1启动子区域结合能力;应用免疫共沉淀(CO-IP)方法检测突变体p53与p68相互作用、p68与Drosha蛋白相互作用;分别稳定转染p68 sh RNA与p68过表达质粒至HEC-1B细胞和无TP53的HEC-50细胞,应用q RT-PCR方法检测转染前后miR-26a表达变化;分别稳定转染不同突变体p53与野生型p53表达质粒至无TP53的HEC-50细胞,应用Western blot方法和q RT-PCR方法检测转染前后EZH2蛋白及miR-26a表达变化;应用RNA-Ch IP方法检测p68、Drosha蛋白与pri-miR-26a-1相互作用,构建荧光素酶报告质粒和应用双荧光素酶检测检测系统验证EZH2是miR-26a调控靶标。结果:(1)沉默突变体p53后pre-miR-26a-1和pre-miR-26a-2表达均升高约2倍(P<0.005),但pre-miR-26a-1基线表达量是pre-miR-26a表达量近150倍(P<0.0001)。(2)野生型p53与miR-26a-1启动子区域能力显著显著大于突变体p53。(3)突变体p53与p68相互结合,沉默p68显著降低miR-26a表达(P<0.001),外源性p68再表达逆转miR-26a表达。(4)野生型p53转入HEC-50细胞增加miR-26a表达而显著抑制EZH2蛋白表达,突变体p53转入HEC-50细胞抑制miR-26a表达而显著增加EZH2蛋白表达。(5)野生型p53转入HEC-50细胞不影响pri-miR-26a-1表达,但显著增加pre-miR-26a-1表达;突变体p53转入HEC-50细胞不影响pri-miR-26a-1表达,但不同程度显著抑制pre-miR-26a-1表达。(6)野生型p53转入HEC-50细胞增加p68与Drosha蛋白相互作用,而突变型p53转入HEC-50细胞显著抑制p68与Drosha蛋白相互作用(7)野生型p53转入HEC-50细胞增加p68、Drosha蛋白与pri-miR-26a-1相互作用,而突变型p53转入HEC-50细胞显著抑制p68、Drosha蛋白与pri-miR-26a-1相互作用。(8)野生型EZH2 3’非翻译区(EZH2 3’UTR)组,miR-26a转入降低荧光强度超过65%(P<0.001),然而突变型EZH2 3’UTR组,miR-26a转入荧光强度仅出现轻度减低(P=0.0122)。结论:p53突变一方面通过失去与miR-26a-1启动子区域结合,失去其转录激活作用,另一方面通过干扰Drosha-p68复合体组装削弱pri-miR-26a-1处理,共同减少miR-26a表达量,EZH2是miR-26a下游直接调控靶标,miR-26a表达减少失去对EZH2表达抑制,故EZH2在突变型子宫内膜癌中高表达。第四部分miR-26a对子宫内膜癌细胞生物学行为影响目的:探索miR-26a对子宫内膜癌细胞迁移、侵袭及上皮-间充质转化(EMT)的影响。方法:分别使用miR-26a mimics及阴性对照瞬时转染EZH2高表达HEC-1B和AN3CA细胞,分别使用anti-miR-26a及阴性对照瞬时转染Ishikawa细胞,应用transwell迁移、侵袭实验检测转染前后子宫内膜癌细胞迁移、侵袭能力改变,应用Western blot方法和免疫荧光方法检测转染前后上皮-间充质转化(EMT)指标E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表达变化。结果:(1)再表达miR-26a显著抑制TP53突变的HEC-1B细胞迁移及侵袭能力,亦抑制EZH2高表达AN3CA细胞侵袭能力。(2)抑制miR-26a表达增加EZH2低表达Ishikawa细胞侵袭能力。(3)miR-26a上调TP53突变的HEC-1B细胞中上皮细胞标志物E-cadherin表达,抑制间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin及Snail蛋白表达。结论:miR-26a通过抑制EZH2促进子宫内膜癌细胞间充质-上皮转化(MET)。第五部分miR-26a调控EZH2表达发挥抑癌作用体内验证目的:探索miR-26a对TP53突变的子宫内膜癌细胞体内成瘤能力的影响并进一步体内实验验证miR-26a对理论靶基因EZH2的表达调控。方法:构建包装miR-26a表达慢病毒(LV-miR-26a)及阴性对照,分别转染TP53突变的HEC-1B细胞后注射于成熟雌性裸鼠颈部皮下进行成瘤实验,分别绘制瘤体生长曲线,进行瘤体称重,应用免疫组织化学方法检测移植瘤中E-cadherin、Vimentin、EZH2和Ki67蛋白表达。结果:(1)转染miR-26a表达慢病毒组肿瘤的体积和瘤体重量明显小于对照组。(2)转染miR-26a表达慢病毒组瘤体组织中上皮标志物E-cadherin高表达、间充质标标记物Vimentin低表达、增殖指标Ki67低表达。(3)转染miR-26a表达慢病毒组瘤体组织中miR-26a下游调控靶标EZH2低表达。结论:体内miR-26a负性调控下游靶标EZH2蛋白的表达并发挥抑癌基因作用。第六部分血清miR-26a表达与临床预后关系目的:检测子宫内膜癌患者血清中miR-26a表达并分析其与临床预后关系。方法:应用q RT-PCR检测子宫内膜癌患者血清中miR-26a表达。结果:(1)与I型子宫内膜癌相比,miR-26a在II型子宫内膜癌患者血清中显著低表达(P=0.0319)。(2)miR-26a低表达提示预后差(Log-rank P=0.0136)。结论:血清miR-26a可能用作判断子宫内膜癌预后指标。