目的:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是发病率为全球第三位的恶性肿瘤,也是致死率为第四位的恶性肿瘤。近20年来,我国结直肠癌的发病率与死亡率呈逐年递增趋势。在初诊时约有25%的患者即被诊断为晚期结直肠癌,而约50%的接受结直肠癌根治手术的早期患者也会进展成为晚期结直肠癌。晚期结直肠癌的治疗效果至今仍不能令人满意,即使接受过化疗及靶向治疗,许多患者仍因疾病迅速进展而死亡。因此,进一步分析结直肠癌的基因组信息,发现并筛选出预测早期肠癌的新的生物标志物,深入研究结直肠癌的发生发展、侵袭和转移的分子机制,对于改善结直肠癌的早期诊治效果,降低结直肠癌的患病率与死亡率具有重要意义。P2X7受体（P2X7R）由位于人类染色质12上的P2rx7基因编码,有13个外显子,编码595个氨基酸组成的膜蛋白。它属于P2X受体家族,该家族的成员可以被细胞外三磷酸腺苷（ATP）激活。P2X7R在不种类型的细胞中都有表达,参与调节炎症,细胞增殖和调亡,新陈代谢和吞噬作用。P2X7R在多种类型的肿瘤中都有异常改变,它与肿瘤的进展、迁移和侵袭高度相关。大多数研究发现P2X7R在许多肿瘤中呈高表达,如乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、甲状腺癌、黑色素瘤等;也有少数研究发现在某些肿瘤中P2X7R呈低表达,如宫颈癌,因此推测P2X7R在肿瘤发生发展中可能起到促癌及抑癌的双重作用。此外,也有报道认为P2X7R可能是候选的肿瘤生物标志物或药理学干预的目标。虽然在结直肠癌中已有关于P2X7R的研究报道,但是P2X7R在结直肠癌的发展过程及生存预后中的作用尚未明确。本课题将对P2X7R在结直肠癌中的表达情况、在结直肠癌预后及转移的作用进行研究,探究P2X7R能否成为结直肠癌的治疗靶标,其抑制剂A438079能否对结直肠癌具有靶向治疗作用及其相关的分子机制。研究方法:1、免疫组织化学染色法（Immunohistochemistry,IHC）检测97例原发性结直肠癌组织及与其配对的正常结直肠组织,各10例的炎性息肉、管状腺瘤、淋巴结转移癌及肝转移癌中的P2X7R表达情况;通过Mann-Whitney U检验分析P2X7R表达情况同临床病理特征之间的关系;通过Kaplan-Meier生存分析法研究P2X7R表达情况同预后之间的关系;通过t检验比较在不同的肿瘤标志物（CEA、CA199、CA724）中P2X7RHigh与P2X7RLow的组间差异。Western-blot法检测结直肠癌的原发癌组织、转移癌组织、肠癌细胞系中P2X7R蛋白表达水平。Real-time PCR（qRT-PCR）法检测结直肠癌的原发癌组织、结直肠癌细胞系中P2X7R的mRNA表达水平。2、培养结直肠癌HCT-116、SW620细胞系,加入不同剂量的P2X7R抑制剂A438079,在培养24h、48h、72h后,观察细胞形态变化。CCK-8法检测对结直肠癌细胞增殖能力的影响;细胞划痕实验检测对结直肠癌细胞迁移能力的影响;Transwell法检测对结直肠癌细胞侵袭能力与迁移能力的影响;Annexin V-FITC/PI双染法检测对结直肠癌细胞凋亡的影响;Western-blot法检测凋亡通路（Bcl-2/Caspase9/Caspase3）、焦亡通路（NLRP3/Caspase1）的相关蛋白表达;qRT-PCR检测凋亡通路（Bcl-2/Caspase9/Caspase3）的相关基因的mRNA表达。3、建立结直肠癌SW620细胞荷瘤鼠模型,用不同剂量的A438079（30、100、300μmol/kg）腹腔灌注,并设立阴性对照组（NaCl）及阳性对照组（5-FU）。HE染色法检测对结直肠癌移植瘤组织形态学的影响;TUNEL法检测对结直肠癌移植瘤组织凋亡的影响;Western-blot法检测结直肠癌移植瘤组织中凋亡通路（Bcl-2/Caspase9/Caspase3）、焦亡通路（NLRP3/Caspase1）的相关蛋白表达。结果:1、IHC结果显示在97例配对结直肠癌标本中,56例标本为P2X7RHigh型,41例标本为P2X7RLow型;P2X7R的表达与淋巴结转移（P=0.001）、TNM分期（P=0.001）、及远隔转移具有显著相关性（P=0.026）,而与年龄、性别、浸润深度、病理类型、肿瘤位置、脉管侵犯、神经侵犯无显著相关性（P>0.05）;P2X7RHigh组患者的OS（Overall survival）比P2X7RLow组患者的OS显著降低（P<0.05）,P2X7RHigh是影响结直肠癌患者OS预后不良的因素;P2X7RHigh与血清CEA水平较有显著相关性（P<0.01）;在10例炎性息肉、管状腺瘤中,P2X7R为轻度的高表达;在10例淋巴结转移癌、肝转移癌中,P2X7R的表达水平高于原发肿瘤。Western-blot结果显示P2X7R在原发结直肠癌组织的相对表达量高于癌旁的正常结直肠组织;在淋巴结转移癌及肝转移癌中,P2X7R的相对表达量同样高于对应的肠原发肿瘤组织;不同的结直肠癌细胞系的P2X7R相对表达量也高于正常结肠细胞系。qRT-PCR结果显示P2X7R mRNA在原发结直肠癌组织中的相对表达量高于相邻正常结直肠组织（P<0.01）;P2X7R mRNA在不同的结直肠癌细胞系的相对表达量也高于正常结肠细胞系（P<0.01）。2、在结直肠癌HCT-116、和SW620细胞中,加入不同浓度的A438079,在24h、48h、72h时发现结直肠癌细胞数量减少,形态由梭形转变为圆形,伴有皱缩、空泡增多。CCK-8实验显示HCT-116、SW620细胞的增殖能力下降:随着A438079浓度的增加与时间的延长,增殖曲线的OD值逐渐降低,最终选择A438079浓度为10μM,时间点为72h作为最佳抑制浓度与抑制时间。细胞划痕实验显示10μM的A438079处理结直肠癌细胞72h后,结直肠癌细胞的迁移能力显著降低:0μM组与10μM组的HCT-116细胞迁移率分别为（33.07±3.85）%与（21.69±2.87）%,（P=0.015）;0μM组与10μM组的SW620细胞的迁移率分别为（23.41±2.45）%与（12.36±1.44）%,（P=0.003）。Transwell实验显示10μM的A438079处理结直肠癌细胞24h后,结直肠癌细胞侵袭能力下降:0μM组与10μM组的HCT-116细胞的穿膜数量分别为（90.87±10.39）个与（51.87±5.66）个,（P=0.0046）;0μM组与10μM组的SW620细胞的穿膜数量分别为（68.60±8.12）个与（37.33±3.95）个,（P=0.0039）。Transwell实验显示10μM的A438079处理结直肠癌细胞24h后,结直肠癌细胞迁移能力下降:0μM组与10μM组的HCT-116细胞的穿膜数量分别为（112.20±12.57）个与（65.93±6.91）个,（P=0.0050）;0μM组与10μM组的SW620细胞的穿膜数量分别为（87.47±9.91）个与（45.87±5.31）个,（P=0.0031）。Annexin V-FITC/PI双染法显示10μM的A438079处理结直肠癌细胞72h后,结直肠癌细胞凋亡增加:0μM组与10μM组的HCT-116细胞凋亡率分别为（7.03±1.01）%与（42.85±5.00）%,（P=0.00）;0μM组与10μM组的SW620细胞的凋亡率分别为（6.66±1.08）%与（48.63±5.43）%,（P=0.00）。Western-blot实验显示,10μM的A438079处理结直肠癌细胞72h后,A438079能够抑制P2X7R蛋白表达,使Bcl-2/Caspase9/Caspase3凋亡信号通路中Bcl-2蛋白表达下调,Bax、Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase3蛋白表达上调,Caspase9、Caspase3蛋白表达不改变;使NLRP3/Caspase1焦亡信号通路中ASC、NLRP3、Cleaved-caspase1、IL-1β蛋白表达下调。qRT-PCR实验显示,10μM的A438079处理结直肠癌细胞72h后,A438079能够使Bcl-2/Caspase9/Caspase3凋亡通路中Bcl-2基因的mRNA表达下调,Bax、Caspase9、Caspase3基因的mRNA表达上调。3、A438079能够抑制裸鼠结直肠癌移植瘤的生长,A438079的剂量越高,移植瘤的体积越小,不同的A438079剂量组与对照组的差异具有统计学意义（P<0.01）。A438079不影响荷瘤裸鼠的体重增长,各组的裸鼠平均体重均随时间的延长而增长,各组间的差异并无统计学意义（P>0.05）。HE染色法显示:A438079剂量越高,瘤组织细胞中的凋亡、胞核皱缩及坏死区域越多。TUNEL染色法显示:A438079可以促进移植瘤组织的凋亡,A438079剂量越高,移植瘤的平均凋亡率越大,不同剂量组与对照组的差异具有统计学意义（P<0.001）。Western-blot显示:随着A438079剂量的增加,P2X7R表达相应下调,使Bcl-2/Caspase9/Caspase3凋亡信号通路中Bcl-2表达相应下调,Bax、Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase3表达相应上调,Caspase9、Caspase3表达无改变;使NLRP3/Caspase1焦亡信号通路中ASC、NLRP3、Cleaved-caspase1、IL-1β的表达相应下调。结论:1、P2X7R在结直肠癌组织中的表达相比癌旁的正常的结直肠组织增高,在结直肠癌的进展中起到了促癌作用;P2X7R可预测结直肠癌的预后,并与结直肠癌的转移密切相关。2、A438079抑制结直肠癌HCT-116、SW620细胞的增殖;A438079抑制结直肠癌HCT-116、SW620细胞的侵袭和迁移能力;A438079通过Bcl-2/Caspase9/Caspase3通路促进结直肠癌HCT-116、SW620细胞的凋亡;A438079通过NLRP3/Caspase1通路抑制结直肠癌HCT-116、SW620细胞的焦亡。3、A438079抑制裸鼠结直肠癌移植瘤的生长;A438079通过Bcl-2/Caspase9/Caspase3通路促进裸鼠结直肠癌移植瘤组织的凋亡;A438079通过NLRP3/Caspase1通路抑制裸鼠结直肠癌移植瘤组织的焦亡。