多发性骨髓瘤（MM）是一种无法治愈的浆细胞肿瘤,但导致其预后不佳的原因至今还有很多不清楚的地方。有研究发现自噬在包括MM在内的很多肿瘤调控中发挥重要作用,自噬是细胞对饥饿、毒性刺激及化疗等的一种反应,通过形成自噬体而对亚细胞成分进行溶酶体降解,并对细胞内成分循环利用,是一种对不利环境的适应性调控。自噬是把双刃剑,具有双重作用:一方面,自噬是细胞能够得以正常生存的一种方式;另一方面,过量自噬可促进细胞自噬性死亡。因此,本研究以自噬作为潜在治疗靶点,对MM细胞的增殖、侵袭及化疗耐药作用机制进行研究。本研究主要包括以下两部分:第一部分:FTY720诱导自噬激活抑制多发性骨髓瘤作用机制的研究目的:S1P（sphingosin 1-phosphate,1-磷酸鞘氨醇）信号通路可激活癌细胞的自噬活动。S1P及其上游的前体物质神经酰胺/鞘氨醇（ceramide/sphingosin,CER/SPH）均为鞘脂类代谢产物。在肿瘤中,S1P主要起抗凋亡及促进肿瘤生长的作用,而CER及SPH则起着促进肿瘤细胞凋亡的作用。S1P/CER平衡的打破是肿瘤细胞（包括MM细胞）生长生存的病理机制之一。而Fingolimod（FTY720）是一种S1P受体拮抗剂,能够抑制S1P信号通路的活性。因此,本研究目的:明确S1P受体拮抗剂FTY720对MM细胞生存与凋亡的影响;阐明FTY720对自噬的调控作用机制;明确靶向S1P受体诱导多发性骨髓瘤细胞死亡的发生机制。研究方法:1、检测FTY720对多发性骨髓瘤患者及4种骨髓瘤细胞系生存率及凋亡的影响。收集5例初诊多发性骨髓瘤患者的骨髓液,提取骨髓单个核细胞,同时以骨髓瘤细胞系U266、LP-1、nci-h929、RPMI8226细胞为研究对象,应用CCK-8法及Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测不同浓度FTY720（0,5,10,15,20μM）对患者骨髓瘤细胞及4种骨髓瘤细胞系存活率以及凋亡率的影响。应用RT-PCR方法检测S1PR在4种骨髓瘤细胞系中的表达情况,选出S1PR高表达细胞系进行后续实验。2、检测FTY720诱导的细胞死亡是否为caspase-3依赖性死亡,应用CCK-8法检测caspase-3抑制剂Z-VAD-fmk存在或不存在时FTY 720处理的RPMI8226细胞的生存情况。检测FTY720诱导的细胞死亡是否由凋亡相关蛋白介导,应用Western blot方法检测FTY 720处理前后凋亡相关蛋白Mcl-1、Survivin、Bcl-2、Bak、Bax的蛋白表达水平。为了研究FTY 720是否能诱导RPMI8226细胞自噬,我们用抗LC3抗体免疫印迹法检测了FTY 720处理后RPMI8226细胞中LC3-I到LC3-II的表达情况,用RT-PCR的方法检测了FTY 720处理后Beclin-1的表达变化。为了进一步阐明自噬在FTY 720诱导的细胞死亡中所起的作用,我们应用CCK-8法及Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测在自噬抑制剂Bafilomycin A1存在或不存在时FTY 720处理的RPMI8226细胞存活、凋亡情况。为明确FTY 720诱导RPMI8226细胞凋亡与自噬、ROS之间关系,FTY720单用及与ROS抑制剂NAC或Tiron联合应用处理RPMI8226细胞后,用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况,用抗LC3抗体免疫印迹法检测LC3-I到LC3-II的转化情况。3、检测S1P5R对RPMI8226细胞生存的影响。用RT-PCR方法检测RPMI8226细胞系5种S1PR（S1PR1,S1PR2,S1PR3,S1PR4,S1PR5）表达水平差异,选出RPMI8226细胞S1P5R本底表达量最高,应用慢病毒干扰S1P5R（siS1P5R）手段对RPMI8226细胞进行S1P5R基因干扰,CCK-8方法检测细胞生存率;应用RT-PCR方法来检测下游信号通路RhoB、ROCK1、Rac1和CDC42的表达情况;应用RT-PCR及Western blot方法检测凋亡及自噬相关蛋白Akt、Survivin、PI3K、mTOR、P53及P62表达变化。结果:1、FTY720表达对骨髓瘤患者细胞及4个骨髓瘤细胞系的凋亡具有促进作用。不同浓度FTY720处理细胞后,CCK-8法检测和流式细胞凋亡检测发现FTY720对细胞凋亡具有显著促进作用,并呈浓度依赖性,且与对照组相比较该差异具有统计学意义。筛选出S1PR本底表达量最高的RPMI8226细胞系作为后续实验。2、为明确FTY 720在RPMI8226细胞中引起的死亡是否为caspase-3依赖性的,我们用5μmol FTY720处理RPMI8226细胞进行CCK-8检测,结果显示细胞的存活率仅为20%,而在caspase-3的抑制剂Z-VAD-fmk的作用下,细胞的存活率可提升到40-60%,并呈剂量依赖性,说明Z-VAD-fmk可以挽救FTY 720引起的细胞死亡。为进一步明确我们观察到的FTY720促进骨髓瘤细胞死亡是否由凋亡相关蛋白介导,我们检测了FTY 720处理前后凋亡相关蛋白Mcl-1、Survivin、Bcl-2、Bak、Bax的蛋白表达水平。结果显示,处理后抗凋亡蛋白Mcl-1、Survivin、Bcl-2的表达明显减少,而促凋亡蛋白Bak、Bax未见明显变化。从而证实FTY720通过调节抗凋亡蛋白的表达而诱导细胞凋亡。为了研究FTY 720是否能诱导RPMI8226细胞自噬,我们用抗LC3抗体免疫印迹法检测了RPMI8226细胞中LC3-I到LC3-II的表达,用RT-PCR的方法检测了Beclin-1的表达水平情况。结果显示:经FTY720处理后的细胞中从LC3-I转换到LC3-II的数量增加,Beclin-1的表达水平明显升高,呈剂量依赖性。从而说明FTY 720能诱导RPMI8226细胞发生自噬。为了明确在FTY 720诱导的细胞死亡中自噬所起的作用,我们检测了在自噬抑制剂Bafilomycin A1存在或不存在时FTY 720处理的RPMI8226细胞的生存情况,结果显示:联合应用FTY720和Bafilomycin A1组细胞生存率明显高于单纯FTY 720组,说明Bafilomycin A1可挽救FTY 720所致的细胞死亡,提示FTY 720诱导的自噬促进细胞凋亡。为了明确ROS在FTY 720诱导RPMI8226细胞凋亡与自噬之间的作用,我们用15μmol/L FTY720处理RPMI8226细胞后,细胞凋亡率较空白对照组明显增加,ROS抑制剂NAC或Tir-on与FTY720共同作用后,可以减轻FTY720引起的细胞凋亡;联合应用ROS抑制剂NAC或Tir-on和FTY720后,LC3B-Ⅱ表达较单用FTY720时明显下降。由此可见FTY 720通过激活ROS诱导细胞凋亡,ROS抑制剂可抑制自噬的发生。3、RT-PCR方法检测RPMI8226细胞主要表达S1P5受体,应用慢病毒干扰技术下调S1P5R的RPMI8226细胞进行研究发现。结果显示,与对照组比较,S1P5R干扰组细胞的生存率明显降低,具有统计学差异。我们分别用0.1μmol S1P,20μmol FTY720和siS1P5R后RPMI8226细胞,应用RT-PCR方法来检测下游信号通路RhoB、ROCK1,Rac1和CDC42的表达情况。结果表明,S1P组中的RhoB、ROCK1,Rac1、CDC42的表达增加,而FTY720组中RhoB、ROCK1,Rac1、CDC42的表达与S1P组相反。S1P5受体被沉默后,Rac1和CDC42的表达下降,但RhoB和Rock1的表达没有变化,说明Rac1、CDC42可能是S1P5R的下游信号通路。对RPMI8226细胞进行S1P5R基因敲减后,应用RT-PCR及Western blot方法检测凋亡及自噬相关蛋白Akt、Survivin、PI3K、m TOR、P53及P62表达情况,结果显示,在mRNA水平,PI3K、AKT及mTOR表达均明显下降;蛋白水平上Akt、Survivin、P62表达明显下降。说明S1P5可调控PI3K/AKT/mTOR信号通路,抑制自噬并上调抗凋亡蛋白Survivin的表达。结论:1、FTY720可促进骨髓瘤细胞的死亡并引起凋亡。2、FTY720可诱导RPMI8226细胞caspase依赖性细胞死亡,可通过调节抗凋亡蛋白的表达而诱导RPMI8226细胞凋亡,并能诱导细胞发生自噬,其诱导的自噬促进细胞凋亡。ROS是FTY720诱导骨髓瘤细胞RPMI8226发生凋亡与自噬的共同调节通路。3、S1P5R是RPMI8226细胞的主要受体,Rac1、CDC42可能是S1P5R的下游信号通路;S1P5可调控PI3K/AKT/mTOR信号通路,抑制自噬并上调抗凋亡蛋白survivin的表达。第二部分:积雪草苷靶向自噬抑制多发性骨髓瘤增殖、侵袭作用机制研究研究目的:越来越多的证据表明,植物来源的分子可能在致命癌症类型的化疗发展中极其有益,但很少有针对治疗多发性骨髓瘤的化疗进展的研究。在这里,我们研究了一种植物源性三萜类化合物--积雪草苷（Asiaticoside）对耐药骨髓瘤细胞系KM3/BTZ的抗癌作用。材料与方法:用CCK-8法测定细胞活力;透射电镜检查细胞自噬情况;流式细胞术测定ROS水平;采用Transwell法检测细胞迁移和侵袭情况;Western blotting检测蛋白表达。结果:结果表明,积雪草苷抑制KM3/BTZ细胞的生长,IC50为12μmol。进一步观察到,积雪草苷的抗癌作用是由于自噬的诱导和LC3-II表达的升高。此外,效应因子caspases在KM3/BTZ细胞中的表达也发生了改变。积雪草苷还可促进KM3/BTZ细胞中ROS的增加,并通过调控STAT3信号通路抑制其迁移和侵袭性。结论:积雪草苷被证明在多发性骨髓瘤的治疗中是有用的,但具体临床应用效果仍需要进一步的研究。