论文部分内容阅读
百菌清(四氯间苯二腈)是一种广谱氯代苯腈类杀菌剂,在农业生产中已使用30年之久,是世界上使用最广泛的杀真菌剂之一,在环境中较稳定、残效期长,且具有明显的蓄积毒性。百菌清的广泛使用及其难降解的特性使得其在温室大棚气体、蔬菜和水果中都可被检测到,其给人类健康和食品安全造成的严重威胁引起了广泛关注。百菌清污染的生物降解被认为是一种有效、安全可靠和无二次污染的方法,具有广泛应用前景。本实验室前期分离到一株高效降解百菌清的菌株Pseudomonas sp.CTN-3,其编码的新颖百菌清水解脱氯酶(Chd)无需其他辅因子就能将百菌清水解为毒性变小、水溶性变大的羟基百菌清。枯草芽孢杆菌由于其非致病性、分泌蛋白能力强和良好的发酵基础应用非常广泛,是一些重要工业酶制剂的生产菌株。本论文将利用含P43启动子功能片段和NprB基因信号肽编码序列,将chd基因整合到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体PP43NMK中构建分泌表达载体pP43Chd,将其转化至枯草芽孢杆菌WB800的感受态中,成功实现chd基因在枯草芽孢杆菌WB800中的高效胞外分泌表达,解决了 Chd胞内表达而后续分离纯化难度高的难题。重组枯草杆菌WB800(pP43Chd)经液态发酵优化(包括单因素实验、Placket-Burman 实验和 Box-Behnken Design 实验),发酵产 Chd 酶活提高了 1.13 倍,达到14.50 U/1。获得最佳培养基配方为:蛋白胨30 g/l、葡萄糖50 g/1、酵母提取物39 g/1、磷酸氢二钾3 g/1、氯化钠3 g/1、硫酸镁3 g/l。最佳培养条件为:接种量10%、pH7.0、30ml/250ml的装液量、培养温度37℃、摇床转速175rpm、培养12h后加入20 mg/1的百菌清,发酵培养24 h后测酶活。重组枯草杆菌WB800(pP43Chd)经固态发酵优化后,发酵产Chd酶活提高了 2.82倍,达到85.60 U/kg干基质,获得固态发酵最佳培养基和培养条件为:小麦秆粉和麸皮各 2g、稻谷壳 1g,K2HPO4 0.4‰、MgSO40.2‰、蛋白胨5%、D-木糖 5%,含水量为60%,接种量为20%,固体基质颗粒大小>2.96 mm、堆料高度为3.3 cm、堆料密度为0.047g/cm3及孔隙度为84.86%时,37‰发酵36h。用最优液态发酵条件下发酵生产的Chd粗酶液对代表不同植物器官的六种蔬菜进行百菌清残留降解实验。结果表明Chd粗酶液对西红柿中百菌清的降解效果最好,百菌清的降解率接近100%,其次是莴苣和生菜,百菌清降解率分别为82%和67%左右,对蘑菇、花菜和胡萝卜中百菌清的降解率处于40%-55%之间。与此同时,酶促反应3 h后,从各种蔬菜洗脱到酶液中的百菌清也基本能完全被Chd降解,酶解反应2 h后残余Chd酶活还维持起始酶活的76%-86%之间。实验结果表明Chd粗酶液能有效去除百菌清污染的瓜果蔬菜表面的百菌清残留,在解决瓜果蔬菜中百菌清农药残留超标污染具有一定的应用前景。