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目的:利用慢病毒载体构建HCN1、HCN2基因沉默大鼠模型,并探讨降低HCN1、HCN2基因表达后对大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤的影响及其分子机制。方法:(1)动物分成Normol组、Scramble组、shRNA-HCN1组、shRNA-HCN2组;针对HCN1、HCN2基因序列选取合适干扰序列,构建慢病毒载体,并通过脑立体定位仪定位,将慢病毒注射到8周龄SD大鼠的右侧脑室。2周后通过激光共聚焦显微镜观察脑片GFP荧光蛋白的表达,并通过免疫印迹、实时荧光定量PCR技术检测HCN1、HCN2蛋白及mRNA的表达,检验基因沉默大鼠模型是否成功。(2)利用尼龙线栓制作大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,大鼠分为Normol组、Sham+Scramble组、MCAO+Scramble组、MCAO+shRNA-HCN1组、MCAO+shRNA-HCN2组,缺血2小时再灌注22小时后进行神经行为学评分和TTC染色。(3)利用实时荧光定量PCR检测脑缺血再灌注损伤后NMDA受体各亚型NR1、NR2A、NR2B、NR3A、NR3B mRNA表达。(4)利用实时荧光定量PCR及免疫印迹法检测脑缺血再灌注损伤后凋亡相关分子AIF、BCL-2、BAX、Caspase-3、P53蛋白及mRNA的表达。结果:(1)激光共聚焦观察结果显示:在Normol组中,脑组织中仅可见微弱荧光;与Normol组比,Scramble组、shRNA-HCN1组、shRNA-HCN2组皮层及海马均有GFP荧光蛋白表达。免疫印迹及实时荧光定量PCR结果显示:与Scramble组比,shRNA-HCN1组皮层及海马区的HCN1蛋白及mRNA表达均降低(P<0.05);与Scramble组比,shRNA-HCN2组大鼠皮层及海马区HCN2蛋白及mRNA表达也降低(P<0.05)。(2)神经功能评分显示:与Sham+Scramble组比,MCAO+Scramble组的神经功能评分增加(P<0.01);与MCAO+Scramble组比,MCAO+shRNA-HCN1组的神经功能评分降低(P<0.05),而MCAO+shRNA-HCN2组的评分则无变化。TTC染色结果显示:与Sham+Scramble组比,MCAO+Scramble组梗死体积增加(P<0.01);与MCAO+Scramble组比,MCAO+shRNA-HCN1组、MCAO+shRNA-HCN2组脑缺血后梗死体积降低(P<0.05)。(3)NMDA受体各亚型的实时荧光定量PCR结果显示:a.在海马组织,与Sham+Scramble组比,MCAO+Scramble组的NR1 mRNA无变化,NR2A、NR2B、NR3A、NR3B mRNA表达下调(P<0.05);与MCAO+Scramble组比,MCAO+shRNA-HCN1组的NR1的mRNA表达下调(P<0.05),NR2A、NR3B mRNA表达上调(P<0.05),NR2B、NR3A mRNA则无变化;与MCAO+Scramble组比,MCAO+shRNA-HCN2组NR2A mRNA表达增加(P<0.05),NR1、NR2B、NR3A、NR3B mRNA均无变化。b.在皮层组织,与Sham+Scramble组比,MCAO+Scramble组的NR1 mRNA表达增加(P<0.05),NR2A、NR2B、NR3A mRNA表达均降低(P<0.05),NR3B mRNA表达无明显变化;与MCAO+Scramble组比,MCAO+shRNA-HCN1组的NR1 mRNA表达降低(P<0.05),NR2A、NR2B、NR3A、NR3B mRNA表达变化;与MCAO+Scramble组比,MCAO+shRNA-HCN2组的NR1 mRNA表达降低(P<0.05),NR2A、NR2B、NR3A、NR3B mRNA表达无明显变化。(4)凋亡相关分子的实时荧光定量PCR结果显示:a.在海马组织,与Sham+Scramble组比,MCAO+Scramble组的AIF、BAX、Caspase-3、P53 mRNA表达上调(P<0.05),BCL-2 mRNA表达下调(P<0.05),BCL-2/BAX的比值降低(P<0.05);与MCAO+Scramble组比,MCAO+shRNA-HCN1组AIF、BAX、Caspase-3、P53 mRNA表达均下调(P<0.05),BCL-2 mRNA表达上调(P<0.05),BCL-2/BAX的比值增加(P<0.05);与MCAO+Scramble组比,MCAO+shRNA-HCN2组P53 mRNA表达下调(P<0.05),AIF、BAX、BCL-2、Caspase-3 mRNA表达均无明显变化(P<0.05)。b.在皮层组织,与Sham+Scramble组比,MCAO+Scramble组AIF、BAX、BCL-2、Caspase-3、P53 mRNA表达上调(P<0.05),BCL-2 mRNA表达下调(P<0.05),BCL-2/BAX的比值降低(P<0.01);与MCAO+Scramble组比,MCAO+shRNA-HCN1组BAX、BCL-2、AIF、Caspase-3、P53 mRNA表达均无明显变化;与MCAO+Scramble组比,MCAO+shRNA-HCN2组的BAX mRNA水平降低(P<0.05),BCL-2/BAX的比值增加(P<0.05),而BCL-2、AIF、Caspase-3、P53 mRNA表达均无变化。(5)凋亡相关分子的免疫印迹检测结果显示:a.在海马组织,与Sham+Scramble组比,BAX、AIF、Caspase-3、P53蛋白表达增加(P<0.05);与MCAO+Scramble组比,MCAO+shRNA-HCN1组BAX、AIF、Caspase-3、P53蛋白表达均减少(P<0.05);与MCAO+Scramble组比,MCAO+shRNA-HCN2组的Caspase-3蛋白表达降低(P<0.05),BAX、BCL-2、AIF、P53蛋白则无明显变化。b.在皮层组织,与Sham+Scramble组比,BAX、AIF、Caspase-3、P53蛋白表达增加(P<0.05);与MCAO+Scramble组比,MCAO+shRNA-HCN1组BAX、AIF、Caspase-3、P53蛋白表达无明显变化;与MCAO+Scramble组比,MCAO+shRNA-HCN2组的BAX蛋白表达减少(P<0.05),AIF、Caspase-3、P53蛋白表达则无明显变化。结论:(1)降低HCN1基因在大鼠皮层及海马表达后,能够减少脑缺血后的脑梗死体积及改善大鼠的神经行为学评分,其机制可能与调节脑缺血后NDMA受体各亚型的表达以及凋亡相关分子的表达有关;(2)干扰HCN2基因表达后,减少了脑缺血后的脑梗死体积,提高了脑缺血后BCL/BAX蛋白的比值,但神经功能评分无明显改善。