论文部分内容阅读
本文以许氏平鮋为研究对象,研究许氏平鮋高迁移率族蛋白(high mobility group protein, HMGB)HMGB1(SsHMGB1)基因和HMGB2(SsHMGB2)基因的结构、表达特征及生物学功能。 本研究主要内容包括:⑴从许氏平鮋中鉴定出SsHMGB1和SsHMGB2两种基因并分析了SsHMGB1全长cDNA序列和SsHMGB2开放式阅读框,对SsHMGB1和SsHMGB2氨基酸序列进行分析并构建系统进化树。结果表明:通过PCR扩增成功克隆出SsHMGB1和SsHMGB2两种基因。SsHMGB1基因全长cDNA包括一个621 bp的开放阅读框,一个62 bp的5’端非翻译区(UTR)和一个645 bp的3’端非翻译区。SsHMGB2开放阅读框长为648 bp。SsHMGB1和SsHMGB2均包含两个典型的HMG结构域和一个酸性羧基末端。经序列比对和构建的系统进化树发现,SsHMGB1氨基酸序列与银鳕鱼的HMGB1的序列同源性最高,为89.4%;SsHMGB2氨基酸序列与银鳕鱼的HMGB2的序列最相近,同源性为88.4%。⑵正常生理状态下从许氏平鮋中取肝脏,脾脏,肾脏,肌肉,血液,脑,肠,鳃,心脏等九个组织,研究SsHMGB1和SsHMGB2在组织中的分布情况;利用鳗弧菌刺激许氏平鮋头肾巨噬研究SsHMGB1的表达水平。结果表明:组织特异性分析发现,SsHMGB1和SsHMGB2在九种组织中均有表达,SsHMGB1在脑中的表达量最高,SsHMGB2在肌肉中表达量最高。此外,SsHMGB1在头肾巨噬细胞中的表达可受鳗弧菌的诱导,且表达水平与诱导时间相关。⑶构建了Transetta/pETHMGB1和Transetta/pETHMGB2表达菌株,通过诱导得到了重组的SsHMGB1(rSsHMGB1)和SsHMGB2(rSsHMGB2)蛋白并进行了纯化。⑷结果表明:一是rSsHMGB1和rSsHMGB2蛋白可以与DNA片段以剂量依赖性的方式结合,浓度为30 ng/mL的蛋白与DNA片段结合的效果显著;二是rSsHMGB1和rSsHMGB2蛋白对许氏平鮋淋巴细胞的增殖和头肾巨噬细胞的呼吸爆发影响效果不显著,加入不同浓度蛋白孵育的实验组与对照组结果差异不明显;三是rSsHMGB1和rSsHMGB2能显著提高巨噬细胞的杀菌活性,并且有效减少病原体在鱼体肾脏内的传播和复制,rSsHMGB2蛋白还能有效减少病原体在鱼体肝脏和脾脏内的传播和复制。加入浓度为80 mg/mL重组蛋白孵育的实验组的杀菌系数与对照组相比差异极显著,腹腔注射50μL含有10?g rSsHMGB蛋白的PBS实验组12h和24h菌落数与对照组差异显著;此外,rSsHMGB1和rSsHMGB2蛋白在头肾巨噬细胞中诱导表达细胞因子,包括TNF-α(肿瘤坏死因子)、TNF13B(肿瘤坏死因子配体超家族成员13B)和IL-1β(白介素1β),这些细胞因子均能参与抗菌防御,加入rSsHMGB1蛋白孵育的实验组诱导TNF-α表达量与对照组相比差异极显著;加入 rSsHMGB蛋白孵育的实验组诱导TNF13B和IL-1β表达量与对照组比差异极显著。