论文部分内容阅读
短链脂肪酸(Short Chain Fatty Acids,SCFAs)不仅可以作为营养物质提供能量,而且作为肠道菌群和宿主之间相互作用的重要信息分子,具有调节营养物质代谢、抑制内源性胆固醇合成等广泛的生理活性和生物学效应。当肠道菌群发生紊乱时,会阻碍机体对SCFAs的吸收,进而影响机体健康,而益生乳酸菌能够通过改善肠道对SCFAs的吸收来发挥其益生作用,但机制尚不明确。因此,本文通过建立体外模拟肠上皮细胞吸收SCFAs模型,筛选促进肠上皮细胞吸收SCFAs的乳酸菌,通过研究其对SCFAs转运体的调节来探讨其可能的作用机制,从而为开发具有促进肠道吸收SCFAs功能的发酵乳制品和益生菌制剂提供理论依据。主要研究内容如下:1.通过耐酸耐胆盐、黏蛋白黏附、Caco-2细胞黏附试验及耐药性试验从源于广西巴马长寿人群的乳酸菌中筛选出高黏附性的乳酸菌菌株。结果表明,40株乳酸菌中,P1、P67、P58、P128等18株乳酸菌在依次经过pH 3.0的人工胃液和0.3%胆盐的人工肠液后的存活率均大于 10%;其中菌株 P123、P198、P97、P58、F146、P1、P11、P67、P54 对黏蛋白和 Caco-2 细胞的黏附率均大于 30%;菌株 P1、P67、P58、P54、P123、P198、P97、F146耐药性较低。经 API 和 16S rDNA 鉴定,菌株 P1、P67、P58、P54、P123、P198、P97 均为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),菌株F146为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。2.通过细胞形态特征、跨膜电阻值(Transepithelial electrical resistance,TEER)、苯酚红通透量(Apparent permeability coefficients,Papp)、细胞超微结构和细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)综合判定Caco-2细胞单层模型的完整性和稳定性。结果表明,将1.2×105 cells/mL Caco-2细胞悬液接种于Transwell 12孔板,Caco-2细胞模型在第7天的细胞TEER值为1032.8 Ω·cm2,第15天为1319.31 Ω·cm2,且Papp值小于1× 10-6 cm/s;在透射电镜下可清晰观察到细胞间形成紧密连接以及微绒毛结构;建立的Caco-2细胞模型可在1 mM丙酸和丁酸溶液中稳定3 h,细胞存活率大于91%,表明该细胞模型建立成功,可用于后续吸收试验研究。3.采用四极杆质谱联用仪,通过全扫及SIM扫描方式来建立细胞内SCFAs的测定方法,选取高黏附性乳酸菌菌株分别接种于含有1 mM丙酸和1 mM 丁酸的Caco-2细胞吸收SCFAs单层模型中,以未接菌的为对照,培养3 h,筛选出对肠上皮细胞吸收SCFAs具有促进作用的乳酸菌。结果表明,测得SCFAs标品溶液的相对标准偏差值(RSD)较小,且在线性范围内的线性良好,相关系数均大于0.999,丙酸和丁酸的质控样本小于30%,实验数据稳定可靠,方法适用于细胞内丙酸和丁酸的检测。对照组中Caco-2细胞内丙酸和丁酸的含量分别为0.156和0.087 μg/mL,接种植物乳杆菌P54、P58、P67、P97、P123、P198的 Caco-2 细胞单层模型中丙酸含量分别为 0.290、0.335、0.282、0.305、0.306、0.311 μg/mL;接种发酵乳杆菌F146和植物乳杆菌P1的Caco-2细胞单层模型中丁酸含量分别为0.092和0.104μg/mL,接种植物乳杆菌P54、P58、P67、P97、P123、P198的Caco-2细胞单层模型中丁酸含量分别为 0.022、0.024、0.024、0.018、0.022、0.021 μg/mL。4.利用实时荧光定量PCR研究乳酸菌对SCFAs转运体基因表达水平的影响。将菌株分别接种于含有1 mM丙酸和1 mM 丁酸的Caco-2细胞吸收SCFAs单层模型中,以未接菌的为对照,培养3 h,收集细胞后进行测定。结果表明,与对照组相比,植物乳杆菌P54、P58、P97、F146、P198、P1均显著上调了 Caco-2细胞MCT1的相对表达量(p<0.05),而植物乳杆菌P54、P58、P67、P97、P123、P198则均显著上调了 SMCT1的相对表达量(p<0.05)。