黄曲霉毒素污染是一个全球性的公共卫生问题,在发展中国家问题尤为严重。黄曲霉毒素主要包括20余种,其中,黄曲霉毒素B1(AFB1)毒性最大,它属于I类强致癌物,主要污染农作物和食物。尽管肝脏一直被认为是AFB1毒作用的重要靶器官,但许多流行病学的研究表明,呼吸道吸入AFB1与人群肺癌的发生有着密切的关系。AFB1的致癌作用与其经代谢活化形成的环氧化物(AFBO)有关,而细胞色素P450(CYP450)酶则是其在体内代谢活化过程中最主要的代谢酶。研究显示,一些CYP450酶,如CYP1A2、CYP3A4以及CYP2A6与AFB1的代谢活化有密切关系,其中CYP1A2是公认的人肝脏代谢AFB1的优势酶,而其在肺脏中表达甚微。近年来的研究发现,CYP2A13也可以高效代谢活化AFB1,生成包括环氧化物在内的多种代谢产物,环氧化物继而在体内与DNA, RNA和蛋白质等生物大分子结合形成DNA加合物,攻击机体内的DNA等生物大分子,引发DNA损伤、细胞凋亡等毒效应,进而引起细胞恶变,引发机体肿瘤。鉴于CYP2A13在人呼吸道和肺脏中特异性的高表达,而CYP1A2几乎不在该组织中表达,提示CYP2A13可能与人呼吸系统原位代谢AFB1并进而引起肿瘤的发生有关。本研究利用细胞及分子生物学手段侧重研究AFB1对高表达CYP2A13的人支气管上皮细胞(BEAS-2B)的毒性作用,通过与CYP2A6和CYP1A2进行比较,探讨CYP2A13代谢活化AFB1并导致细胞毒作用的能力,为阐明AFB1与人呼吸系统肿瘤的关系提供线索。目的通过建立高表达CYP2A13的BEAS-2B的细胞模型(BEAS-2A13),观察和比较CYP2A13代谢活化AFB1并进而导致细胞毒作用的能力,为系统研究CYP2A13的功能并为阐述CYP2A13在AFB1引起呼吸系统肿瘤中的作用提供线索。方法用PCR方法在CYP2A13 cDNA的上游扩增酶切位点NheⅠ,在其下游扩增酶切位点XhoⅠ,用限制性内切酶NheⅠ和XhoⅠ分别将CYP2A13 cDNA、CYP2A6 cDNA和pLJM1载体双酶切后进行酶连。用限制性内切酶EcoRⅠ分别将CYP1A2 cDNA和pLJM1载体单酶切后进行酶连。构建pLJM1-CYPs重组质粒,并进行PCR验证和测序验证。使用慢病毒体系将重组质粒转染入SV40永生化的人BEAS-2B细胞中,建立高表达CYP2A13、CYP2A6、CYP1A2的细胞模型(BEAS-2A13,BEAS-2A6,BEAS-1A2),同时构建空载体细胞模型(BEAS-vector);采用流式细胞仪筛选阳性和阴性细胞;用Western Blot方法对建立的细胞模型进行验证。应用0 nM,10 nM, 100 nM , 1000 nM和10,000 nM的AFB1对建立的细胞模型处理24 h后,用MTT法检测细胞活性;用100 nM的AFB1对建立的细胞模型处理24 h、48 h和72 h后,用MTT法检测细胞活性。用0 nM、10 nM、100 nM的AFB1对建立的细胞模型处理24 h后,用Hoechst 33258染色法及流式细胞仪检测细胞凋亡;用100 nM的AFB1对建立的细胞模型处理6 h、12 h、24 h、48 h和72 h后,用Hoechst 33258染色法及流式细胞仪检测细胞凋亡。结果1.经过选择合适的酶切位点,通过酶切和酶连反应,获得了pLJM1-CYPs慢病毒重组质粒,经过PCR验证和测序验证均证明重组质粒构建成功,没有突变。2.成功地运用慢病毒体系将重组质粒转染入293T细胞中,获得了病毒颗粒,并感染了BEAS-2B细胞。随后利用流式细胞仪进行分选,筛选出高纯度的高表达CYPs的BEAS-2B细胞。3.采用Western blot方法对转染了pLJM1-CYP2A13, pLJM1-CYP2A6, pLJM1-CYP1A2和pLJM1载体的BEAS-2B细胞进行验证, BEAS-2A13和BEAS-2A6得到了45 KD的条带,BEAS-1A2得到了55 kD的条带,与各阳性对照的条带一致,转染了pLJM1载体的BEAS-2B细胞及正常的BEAS-2B细胞无条带,证明高表达CYPs的细胞模型构建成功。4.用0 nM、10 nM、100 nM、1000 nM和10,000 nM的AFB1对各组细胞模型处理24 h后,用MTT法检测各组细胞模型的活性。随着AFB1浓度的增加,各转染CYPs的BEAS-2B细胞模型的活性都呈剂量依赖性下降,在10,000 nM时,三种BEAS-CYPs细胞模型的活性都显著下降(P<0.01)。与BEAS-1A2细胞和BEAS-2A6细胞相比,BEAS-2A13细胞在100 nM AFB1处理后,活性都显著下降(P<0.01)。其IC50值为350 nM,而BEAS-1A2的IC50值为2200 nM,BEAS-2A6和BEAS-Vector的IC50值都大于10000 nM。此外,随着处理时间的增加,各细胞活性都呈时间依赖性下降,处理72 h后,三种细胞的活性都明显下降(P<0.01)。在每个处理时间点,BEAS-2A13的活性和其它细胞模型相比都明显下降(P<0.01)。结果说明BEAS-2A13对AFB1最敏感,其次是BEAS-1A2,BEAS-2A6相对较弱。5.利用Hoechst33258染色观察细胞凋亡的形态学改变,凋亡细胞核呈致密浓染、碎片状。随着AFB1浓度的增加,各转染CYPs的BEAS-2B细胞凋亡率都呈剂量依赖性上升,无论是10 nM还是100 nM剂量组,各BEAS-CYPs的凋亡率都显著高于空载细胞(P<0.01),且BEAS-2A13细胞的凋亡率显著高于BEAS-2A6和BEAS-1A2细胞(P<0.01)。流式细胞检测结果也显示,随着AFB1浓度的增加,三种细胞的死亡率和晚期凋亡率都呈剂量依赖性上升, BEAS-2A13死亡率和晚期凋亡率最高,上升幅度最快,其次为BEAS-1A2和BEAS-2A6细胞。两个实验结果都提示AFB1能诱导更多的BEAS-2A13发生凋亡。此外,随着处理时间的延长,BEAS-2A13和BEAS-1A2细胞的凋亡率呈时间依赖性上升,而BEAS-2A6和空载细胞的变化不明显。BEAS-1A2自12 h处理组后,与空载细胞相比出现明显上升,随着时间的延长,差异逐渐加大;BEAS-2A13在每个时间点都显著高于其它三组细胞(P<0.01)。BEAS-2A6在各个时间点的凋亡率与空载细胞相比,均无显著差异。流式细胞仪检测结果也显示,随着处理时间的延长,三种细胞的死亡率均呈时间依赖性上升,BEAS-2A13细胞死亡率上升幅度最大。BEAS-1A2随时间的延长,死亡率有一定程度地增加,而BEAS-2A6则变化不明显。各组细胞的晚期凋亡率在24 h达到高峰,48 h时略有下降,变化幅度最大的是BEAS-2A13细胞。结论1.利用慢病毒系统成功构建了高表达CYP2A13、CYP2A6和CYP1A2的BEAS-2B细胞模型。2.利用转染细胞模型,通过细胞毒性和细胞凋亡评价,初步证实了CYP2A13具有很强的代谢活化AFB1能力,不仅强于传统优势酶CYP1A2,更远强于其同源酶CYP2A6,为系统阐明CYP2A13的功能及其在AFB1所致呼吸系统肿瘤中的作用提供线索。