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背景:鬼箭羽是卫矛属植物卫矛的具翅状附属物,是一种药用植物,始载于《神农本草经》。在古代,鬼箭羽主要用于妇科疾病,在《本草纲目》中记录了鬼箭羽在阴道流血、腹胀以及解毒等方面的作用;在现代,鬼箭羽主要用于糖尿病及其并发症和肿瘤等,然而鬼箭羽的药效成分以及作用机制并不清楚。基于此,本实验对鬼箭羽中化学成分进行系统性研究,并进行含量测定以及体外抗氧化活性的测定;通过细胞迁移以及毛细血管样结构的形成等实验筛选出化合物EA-3在糖尿病视网膜病变方面有较强的作用;然后进行药效实验和机制探索:在CAM和OIR小鼠模型体内,EA-3可以显著抑制CAM中新生血管的形成和OIR小鼠视网膜中病变血管簇的形成,促进病变血管趋于正常化;EA-3抑制血管生成的作用机制可能是抑制高糖诱导的VEGF-VEGFR介导的Hippo信号通路核心蛋白的表达。目的:利用传统的提取分离技术以及液质联用技术对鬼箭羽中的化学成分进行系统的研究;并从已分离得到的化合物中选择指标性成分,建立指标性成分的含量测定方法,为完善鬼箭羽的质量标准提供数据支持;通过体内以及体外实验考察鬼箭羽中化合物EA-3的药理作用以及作用机制,为鬼箭羽的开发与利用提供理论依据。研究方法:1.鬼箭羽化学成分研究:利用硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱、C18柱色谱等传统的分离技术对鬼箭羽乙酸乙酯萃取部位进行分离纯化。利用液质联用以及核磁共振等技术鉴定分离得到的单体化合物。通过查阅文献归纳、总结鬼箭羽中已知化合物相对分子质量、裂解规律等,建立鬼箭羽已知化合物数据库;总结文献中黄酮类化合物、脂肪族类化合物、甾体类化合物等的质谱裂解规律,利用化合物裂解规律,鉴定鬼箭羽中未知化合物。利用鬼箭羽已知化合物数据库和各类化合物的质谱裂解规律对鬼箭羽甲醇提取物中的化学成分进行快速识别。2.鬼箭羽药材含量测定方法研究:原儿茶酸、槲皮素、山奈酚为指标性成分,利用HPLC技术建立鬼箭羽中三个多酚类化合物含量测定方法。首先对仪器以及实验方法进行方法学考察包括标准曲线绘制、精密度试验、重复性试验、稳定性试验、回收率试验;方法学考察合格后,利用HPLC技术以相同的实验方法对供试液中三种多酚类化合物进行含量测定。3.鬼箭羽中多酚类化合物抗氧化活性评价:采用体外DPPH法测定鬼箭羽中原儿茶酸、槲皮素、山奈酚这三种多酚类化合物体外抗氧化活性,并以天然抗氧化剂抗坏血酸Vc作为对照。4.EA-3抑制糖尿病视网膜病变的作用机制研究:利用Transwell迁移实验检测RVECs RF/6A细胞迁移情况;利用Matrigel实验检测RVECs RF/6A细胞毛细血管样结构形成的情况;利用Western Blot实验检测VEGF-VEGFR和Hippo信号通路相关蛋白的表达;利用CAM实验检测体内新生血管的情况;利用OIR小鼠模型实验考察小鼠视网膜病理性血管簇以及无血管区域情况。研究结果:1.从鬼箭羽乙酸乙酯部位分离得到12个化合物,其中包括6个黄酮类化合物、2个甾体类化合物、1个酚酸类化合物、1个三萜类化合物、1个脂肪族类化合物、1个苯丙素类化合物。单体化合物为:木栓酮(1)、豆甾醇(2)、EA-3(3)、α-羟基棕榈酸甲酯(4)、3-(4-羟基-2-甲氧基苯基)-丙烯酸-4-羟基-3-甲氧基苯基酯(5)、芹菜素(6)、柚皮素(7)、山奈酚(8)、槲皮素(9)、橙皮苷(10)、芦丁(11)、原儿茶酸(12)。其中,化合物α-羟基棕榈酸甲酯与3-(4-羟基-2-甲氧基苯基)-丙烯酸-4-羟基-3-甲氧基苯基酯为首次从鬼箭羽中分离得到。利用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技术,从鬼箭羽甲醇提取物中鉴定出65种成分,包括36种黄酮类、4种酚酸类、7种三萜类、12种脂肪族类和6种其他类成分,且有26个单体成分为首次在该植物中报道。2.对提取方法、提取溶剂以及检测波长进行考察与优化,首次建立了HPLC法同时测定鬼箭羽中三种多酚类化合物含量测定的方法。结果表明,原儿茶酸、槲皮素和山奈酚的进样量在3.2-1208、3.6-1440、4.0-1600ng范围内与色谱峰面积积分值呈线性关系,回归方程为y=3055.4x-5311.9、y=4377.6x-31603、y=3015.9x-49183;方法学考察结果RSD均小于3%,加样回收率(n=9)在100.09%-100.57%,RSD小于3%。该方法简单、准确、快速、重复性高可以用于鬼箭羽中三种多酚类化合物含量测定。采用回归方程计算样品中原儿茶酸、槲皮素和山柰酚含量分别为:14.80、19.09、33.29 μg·g-1。3.体外DPPH法结果表明,鬼箭羽中三种多酚类化合物在体外均有DPPH自由基清除作用,清除DPPH自由基的能力依次为槲皮素>原儿茶酸>Vc>山奈酚,提示这三个多酚类化合物具有体外抗氧化活性。4.Transwell迁移实验结果表明,EA-3明显减少高葡萄糖引起的RVECs RF/6A细胞的迁移数量,最高抑制率可达148.98%。Matrigel实验结果表明,EA-3处理后高葡萄糖引起的毛细血管样网络长度明显减少,最高抑制率可高达231%。Western Blot实验结果表明,EA-3可以显著抑制由高糖引起的VEGF-VEGFR介导的Hippo信号通路中核心蛋白的增加。CAM实验结果表明,EA-3处理后,与空白对照组相比,CAM中新生血管面积明显减少,最高抑制率可达41.17%。OIR小鼠模型实验结果表明,EA-3处理后,与模型组相比,视网膜中病变血管簇和无血管区域减少,血管生长正常化。结论:通过对鬼箭羽化学成分系统性研究,建立鬼箭羽中化合物分离和分析的方法,为鬼箭羽药效成分研究提供物质基础;利用HPLC技术,建立鬼箭羽药材含量测定方法,为完善鬼箭羽药材质量标准提供理论依据。EA-3可能具有抑制血管生成的作用,通过减少VEGF-VEGFR介导的Hippo信号通路中核心蛋白的表达抑制体外和体内血管生成的。