樟芝又名牛樟芝,是我国台湾特有的一类十分稀有的药食两用真菌。樟芝含有多糖、三萜类化合物、马来酸和琥珀酸衍生物以及泛醌类衍生物等多种生理活性物质,具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、保护肝脏、免疫调节和降血糖等多种药理活性。安卓奎诺尔是樟芝的特征性代谢产物之一,具有显著的抗癌活性,且对于癌细胞与正常细胞具有选择性。目前国内外与安卓奎诺尔相关的研究基本集中在其药理活性方面,而对于其生物合成方面的研究非常欠缺。本课题组的前期研究发现安卓奎诺尔只存在于樟芝固态发酵菌丝体和野生子实体中,普通的液态发酵条件无法合成安卓奎诺尔。论文通过添加前体物质和效应物,促使樟芝液态发酵合成安卓奎诺尔,并在此基础上对樟芝液态发酵合成安卓奎诺尔的机理进行了研究,同时优化了其发酵条件,为樟芝液态发酵合成安卓奎诺尔的研究提供依据同时为安卓奎诺尔的工业化生产打下基础。论文的主要研究结果如下:(1)安卓奎诺尔标准品的制备确定了安卓奎诺尔的提取条件为提取溶剂乙醇,料液比1:20(g·m L-1),萃取温度40℃,萃取时间90 min时,提取效率可达95%左右;当纯化条件为两次硅胶柱层析法,其中第一次硅胶柱层析的条件为:乙酸乙酯和正己烷梯度洗脱(0:10-5:5),径高比为1:30,上样量为1:40(w样品/w硅胶),洗脱流速为2.0 BV·h-1时,纯化得到的安卓奎诺尔的纯度为70.1%。第二次硅胶柱层析的条件为:洗脱剂为苯和丙酮(7:3),径高比为1:10,上样量为1:50,洗脱流速为1.0 BV·h-1时,安卓奎诺尔的纯度可以达到91.03%。经HPLC-MS和核磁共振鉴定,确定其为安卓奎诺尔标准品。(2)安卓奎诺尔合成的前体物质的研究选择对羟基苯甲酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、香叶醇、天冬氨酸、丙酸和辅酶Q0等8种安卓奎诺尔合成过程中可能的前体物质,研究了其对液态发酵体系中安卓奎诺尔合成的影响。结果表明,对羟基苯甲酸、香叶醇和辅酶Q0的添加能够促进樟芝液态发酵合成安卓奎诺尔。当对羟基苯甲酸的添加量为0.01%(w/v),添加时间为24 h时,安卓奎诺尔的产量为14.91 mg·L-1;香叶醇的添加量为0.08%(w/v),添加时间为72h时,安卓奎诺尔的产量为10.21 mg·L-1;辅酶Q0的添加量为0.03%(w/v),添加时间72h时,安卓奎诺尔的产量为31.44 mg·L-1。在确定最佳添加条件的基础上,对前体物质的协同添加效果进行研究发现当辅酶Q0和对羟基苯甲酸复合添加时效果最佳,此时液态发酵中安卓奎诺尔的产量由初始的无法合成,提高到82.22 mg·L-1。(3)添加辅酶Q0对樟芝菌丝体蛋白质组影响的研究为了进一步阐明添加前体物质能促进樟芝液态发酵中安卓奎诺尔合成的机制,对有无添加辅酶Q0的樟芝液态发酵菌丝体进行了差异蛋白质组研究。利用苯酚抽提法提取樟芝液态发酵菌丝体蛋白,并对其进行双向电泳,得到的图谱经PDQuest软件分析可以得到约480个蛋白点,其中添加与未添加辅酶Q0的樟芝液态发酵菌丝体的双向电泳图谱有60个差异蛋白点,经过MALDI-TOF/TOF-MS鉴定得到30个蛋白点,其中4个上调蛋白点,26个下调蛋白点。对鉴定得到的蛋白点按其生化过程分为8种不同的功能基团。其中上调蛋白主要通过促进甲基的转移以及对樟芝菌丝体的生长进行刺激来促使安卓奎诺尔的合成,下调蛋白主要是樟芝菌丝体内TCA循环的关键酶,这些蛋白的表达量降低促使TCA循环过程的中间产物用于安卓奎诺尔的合成。(4)安卓奎诺尔合成的效应物的研究分别选择樟脑油、樟树萃取液、烟叶萃取液、胡萝卜汁和西红柿汁等5种效应物和花生油、菜籽油、大豆油、棉籽油、葵花籽油和橄榄油等6种植物油,研究了其对樟芝液态发酵合成安卓奎诺尔的影响。结果表明,效应物中樟树萃取液和烟叶萃取液能够促进安卓奎诺尔的合成;植物油中豆油对于樟芝液态发酵的菌体量和安卓奎诺尔的合成的效果最佳。当樟树萃取液的添加时间为72 h,添加量为2%(v/v)时,安卓奎诺尔的产量为31.42 mg·L-1;烟叶萃取液的添加时间为72 h,添加量为40%(v/v)时,安卓奎诺尔的产量为10.69 mg·L-1;豆油的添加时间为0 h,添加量为10%(v/v)时,安卓奎诺尔的产量为89.06 mg·L-1。在此基础上对樟树萃取液、烟叶萃取液和豆油的复合添加效果进行研究,发现樟树萃取液和烟叶萃取液的复合添加对安卓奎诺尔的合成具有一定的促进作用。对豆油促进樟芝液态发酵合成安卓奎诺尔的机理进行研究,结果表明豆油在樟芝液态发酵过程中不会被当作营养物质进行利用,主要是通过促进氧传递、改变细胞膜通透性以及萃取胞内代谢产物来促进安卓奎诺尔的合成。(5)安卓奎诺尔合成的液态发酵条件优化对前体物质和效应物的复合添加效果进行了研究,结果表明当辅酶Q0与豆油进行复合添加时的效果最佳。在复合添加辅酶Q0和豆油的前提下,对樟芝液态发酵合成安卓奎诺尔的培养基及发酵条件进行优化。当樟芝液态发酵合成安卓奎诺尔的碳源为米粉50 g·L-1;氮源为大豆粉6 g·L-1和玉米浆粉8 g·L-1;初始pH值4.6;接种量10%;发酵温度为28℃到25℃,变温时间第3 d;摇床转速为150 r·min-1时,安卓奎诺尔的产量可以达到175.34 mg·L-1。