昆虫是世界上数量最多、分布最广的动物,这与其惊人的适应能力密不可分。滞育(diapause)便是昆虫对环境适应性的一个重要生理特性。滞育是指生物体受环境的诱导,发育到某一阶段停滞生长和发育以度过不良生活环境的一种生理状态。滞育不同于休眠(dormancy),在滞育过程中,即使给予适宜的环境也不会即刻打破滞育而继续发育,相反,适宜的环境正适于滞育状态的维持。滞育对于昆虫具有重大的意义:一方面度过不良的生存环境,使其生活周期与取食季节一致;另一方面,滞育解除后使种群发育齐一,可以提高雌雄交配机会,利于种群的繁衍生存。因此,滞育在昆虫的生存、繁衍和进化过程中发挥着重要的作用。家蚕(Bombyx mori)作为重要的经济昆虫和优秀的模式生物,其滞育现象一直是研究的热点。对家蚕滞育的机制进行研究,一方面为昆虫滞育的研究提供理论基础;另一方面使研究成果应用于蚕业实践,以扩大蚕业生产,充分发挥其经济性状;同时,对于滞育机制的进一步了解,还可以应用于害虫防治,对农业生产和环境保护都具有重大意义。本研究立足于家蚕不同化性品系滞育性的不同,探究家蚕TrpA1基因对二化性品系滞育影响的机制;同时,利用数字表达谱测序筛选与家蚕滞育相关的差异表达基因并对差异基因进行鉴定和功能验证。主要获得如下研究结果:1.家蚕TrpA1基因的克隆及生物信息学分析为了探究BmTrpA1基因对不同化性品系滞育性影响的机制,我们对BmTrpA1基因在家蚕三种化性品系中进行了克隆,并对BmTrpA1基因编码的蛋白进行了生物信息学分析。BmTrpA1基因的克隆结果显示,所调查的三种化性家蚕品系在该基因的ORF框3360bp中有30处单碱基多态性,所编码的氨基酸序列在一化、二化和多化性品系家蚕之间有三个氨基酸的差异。生物信息学分析表明,三种化性家蚕品系的bmtrpa1基因所编码的蛋白结构没有差异。我们推测不同化性品系家响应温度调控子代滞育性差异的原因可能并不是bmtrpa1基因本身的序列结构所致,而是因为bmtrpa1基因调控序列的改变。2.家蚕trpa1基因在不同化性品系中胚胎期转录水平表达分析为了探究bmtrpa1基因在不同化性品系中表达模式是否存在差异,我们利用qrt-pcr检测每个品系胚胎期bmtrpa1基因的转录水平。结果显示,bmtrpa1基因在一化性和多化性品系中,25℃和15℃暗催青条件下的整个胚胎期的表达量相近,表达模式相似;二化性品系中,在胚胎对温度异常敏感的两个时期即反转期和点青期bmtrpa1基因在15℃暗催青条件下的表达量要高于25℃暗催青条件下的表达量,并且,bmtrpa1基因在15℃暗催青条件下出现表达高峰。由此我们推测bmtrpa1基因在二化性品系中通过改变表达模式参与调控二化性品系家蚕卵的滞育,而在一化性和多化性品系中不涉及家蚕卵滞育性的调控。3.不同化性品系家蚕trpa1基因上游序列重测序比对分析本实验选取了三种化性21个品系的家蚕以大造(dazao)基因组为参考基因组进行bmtrpa1基因上游5kb(scaf23:3595057-3600057)序列的重测序比对分析。结果显示snp位点主要集中于bmtrpa1基因上游scaf23:3596000-3597000这1kb范围内。随后,通过genomatix网站预测这1kb序列的顺势调控原件,结果鉴定出61个转录因子结合位点。其中包含一个热激蛋白的转录因子结合位点,是受温度调节的转录因子结合位点,此处发生单个核苷酸的变异就有可能涉及我们所研究的与温度相关二化性家蚕滞育性的不同。这些变异位点的集合为我们进一步探究bmtrpa1基因对家蚕二化性品系滞育的调控作用提供了依据。4.家蚕二化性品系胚胎的数字基因表达谱测序及数据分析为了进一步分析二化性家蚕品系响应温度调控子代滞育性状的相关分子机制,我们取二化性品系dazao在不同催青温度(25℃/15℃)条件下发育至点青期的胚胎构建了两个文库:25-hp(headpigmentation)和15-hp,进行数字基因表达谱测序,并对测序数据进行评估与统计。分析结果显示对样本与参考基因组的比对、测序饱和度的检测以及测序随机性检测的考量,都说明测序的质量较高。同时,对数字基因表达谱测序结果利用qrt-pcr进行了实验验证,在滞育相关keggpathway中选取的19个基因中,有16个基因的表达情况都与测序结果具有一致性,这一结果说明了qrt-pcr和数字基因表达谱测序数据之间的一致性,表明测序结果可靠度较高,可以进行后续的分析。同时测序结果显示,两个样本比较共得到690个差异表达基因(fdr≤0.001and|log2ratio|≥1),其中有335个基因上调表达,355个基因下调表达。测序所得的差异表达基因中,其中434个基因参与了生物学进程;263个基因参与了细胞组分;278个基因参与了分子功能。测序共富集到了203条KEGG pathway,其中在差异表达基因中显著富集的pathway(Qvalue≤0.05)有29条。5.家蚕滞育相关基因的筛查鉴定与功能验证对家蚕二化性品系大造(Dazao)不同处理条件下的点青期胚胎进行数字基因表达谱测序,经过Gene Ontology以及KEGG Pathway分析,再结合文献中对昆虫滞育的研究结果,我们筛选到了period、timeless和takeout三个基因可能参与到二化性品系家蚕卵滞育的进程。首先荧光定量PCR结果显示period和takeout基因在家蚕一化性品系J106、二化性品系Dazao和多化性品系Nis中不同催青条件下整个胚胎期高表达时,只有二化性Dazao中25℃催青条件下period和takeout基因的表达量明显高于15℃催青条件下的表达量。基于以上发现,我们进一步推测period和takeout基因很可能参与二化性家蚕催青温度对子代滞育性的调控。因此,利用RNAi实验来验证period和takeout基因在家蚕滞育方面的功能。首先合成了period和takeout基因的dsRNA,并对二化性家蚕品系Dazao低温催青后,雌蛾产下的非滞育蚕卵(2h内)进行注射,注射蚕卵在25℃条件下催青后饲喂直至化蛾产卵,结果发现注射了period和takeout基因dsRNA后的蚕卵的子代仍然进入了滞育。家蚕滞育是一个复杂的调控进程,基于此结果,我们正在重复功能验证实验,利用基因编辑技术对period和takeout基因进行敲除,并且对敲除结果进行检测,以便进一步确定period和takeout基因对二化性家蚕响应温度调控子代卵滞育性的作用。