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[目的]构建乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子区(BCP)1762／1764双突变株的复制质粒。定量检测未发生肝癌的慢性乙型肝炎病人和己发生肝癌的慢性乙肝病人血清和肝组织中乙型肝炎病毒BCP区A1762T／G1764A双突变,探讨此双突变和肝癌的关系及意义。
[方法]
(1)利用已有1.5拷贝HBV野生型全基因组序列质粒(pHBV1.5,C型)为模板,采用分子克隆、大引物定点突变方法构建BCP区A1762T／G1764A双突变重组质粒。
(2)将野生株重组质粒和双突变重组质粒分别转染到HepG2.0细胞,测定其细胞培养液HBV DNA和HBsAg水平来测定双突变质粒的复制能力和蛋白表达能力。
(3)以野生株重组质粒和双突变重组质粒基因序列设计特异性TaqMan MGB探针。
(4)采用特异性探针实时荧光定量PCR(PSRT-PCR)方法准确检测样本双突变。
(5)对比野生株重组质粒和双突变重组质粒在体外转染培养后的复制能力；比较双突变在未发生肝癌的慢性乙型肝炎病人和已发生肝癌的慢性乙肝病人血清和肝组织中的发生情况。统计学分析采用SPSS16.0统计学软件处理,计量资料采用t检验、F检验和Cochra-Cox近似t检验,计数资料采用Fisher确切概率法、x2检验。
[结果]
(1)成功构建BCP区A1762T／G1764A双突变复制质粒,经转染细胞培养后测定HBV DNA水平,双突变株复制能力高于野生株[(3.29±1.27×105copies／ml)vs(1.24±0.24×105copies／ml)]。
(2)成功制作用于同时检测HBV DNA和双突变拷贝量的。TaqMan MGB探针。
(3)成功使用PSRT-PCR方法快速、特异、准确检测乙肝病毒HBV BCP区A1762T／G1764A双突变。
(4)对从未进行抗病毒治疗的80例慢性乙肝病人和50例肝癌病人分别予血清和肝组织双突变定量检测,发现无肝癌慢性乙肝病人组血清突变率为41.25％(33／80),肝组织突变率为45.00％(36／80)；肝癌组血清突变率为68.00％(34／50),肝组织突变率为78.00％(39／50),两组比较有统计学差异,每组各自血清和肝组织突变率比较无统计学差异。
(5)将无肝癌慢性肝病组分为高病毒载量组(HBV DNA≥106 copies／mL,43例)和低病毒载量组(HBV DNA<106 copies／mL,37例),发现高病毒载量组血清和肝组织突变率均高于低病毒载量组[分别为58.14％(25／43)对比21.62％(8／37)与62.79％(27／43)对比24.32％(9／37)],经比较有统计学差异。
[结论]
(1)体外转染培养结果表明,存在BCP区A1762T／G1764A双突变的乙肝病毒其复制能力高于无此突变的野生型病毒。
(2)使用特异性TaqManMGB探针的PSRT-PCR检测方法检测双突变具有良好的灵敏度、特异性和重复性,达到临床检测要求。
(3)已发生肝癌的慢性乙肝病人BCP区双突变发生明显高于未发生肝癌者,提示此双突变和肝癌的发生密切相关,检测此双突变有助于预测肝癌的发生。
(4)血清检测和肝组织检测具有良好一致性,对于无法进行肝组织取材的病人检测血清可以准确反映其突变情况,适合临床推广应用。
(5)未发生肝癌的慢性乙肝病人病毒载量高提示双突变发生率高,及早进行抗病毒等治疗有助于降低双突变发生率。