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目的:本科室前期通过质谱检测发现,DOC-1R(Deleted In Oral Cancer-1 Related)可能与酪蛋白激酶2(Casein Kinase 2,CK2)的α亚基及过氧化物酶1(peroxiredoxin 1,PRDX1)具有相互作用,本研究通过Pull-Down、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-Ip)等方法证实DOC-1R与CK2α及PRDX1的相互作用,并通过构建DOC-1R截短蛋白载体及Pull-Down分别初步探究DOC-1R与CK2α及PRDX1蛋白的结合区域,为进一步研究DOC-1R的生物学功能及其作用机制奠定基础。研究方法:1 GST Pull-Down分别检测DOC-1R与CK2α及PRDX1的结合将转化有pGEX-5X-1及重组载体pGEX-DOC-1R的E.coli BL21菌株进行诱导表达,所得到的菌体裂解后收集GST蛋白及GST-DOC-1R融合蛋白,与MagneGST particle混匀孵育,加入HEK-293细胞总蛋白进行GST Pull-Down实验,Western Blot分别检测DOC-1R与CK2α及PRDX1蛋白的结合情况。2 Co-Ip分别检测DOC-1R与CK2α及PRDX1的相互作用常规培养DOC-1R及对照病毒感染的HeLa细胞,裂解细胞获得总蛋白,分为两个实验组:分别用FLAG抗体、CK2α抗体或PRDX1抗体进行免疫共沉淀反应,通过Western Blot方法分别检测DOC-1R与CK2α及PRDX1蛋白的相互作用。3构建缺失型DOC-1R原核表达载体,诱导表达重组蛋白并通过GST Pull-Down分别检测DOC-1R与CK2α及PRDX1的结合区域以本室前期构建的pGEX-DOC-1R质粒为模板,分别构建pGEX-DOC-1RdelC42、pGEX-DOC-1RdelN42、pGEX-DOC-1RdelN63三种缺失型DOC-1R原核表达载体。经菌落PCR鉴定,扩大培养阳性克隆菌落,提取质粒进行酶切鉴定后对三种缺失型pGEX-DOC-1R重组表达载体进行DNA测序分析。将编码序列正确、开放阅读框架完整的三种缺失型pGEX-DOC-1R重组表达载体转化E.coli BL21感受态细胞中,诱导表达并收集菌液。将菌液进行SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色并脱色以检测融合蛋白的表达情况。将新构建的三种含有缺失型DOC-1R的大肠杆菌(pGEX-DOC-1RdelC42、pGEX-DOC-1RdelN42、pGEX-DOC-1RdelN63)、本科室前期构建及保存的含有缺失型DOC-1R的大肠杆菌(pGEX-DOC-1RdelC63、pGEX-DOC-1RdelC30、pGEX-DOC-1RdelC20、pGEX-DOC-1RdelC7)及对照菌分别诱导表达,并将得到的菌液裂解,收集融合蛋白,与MagneGST particle混匀孵育,4 h后加入HEK-293细胞总蛋白混匀孵育过夜,Western Blot分别检测缺失型DOC-1R蛋白与CK2α及PRDX1的结合。结果:1 GST Pull-Down实验证明DOC-1R分别结合CK2α及PRDX1蛋白通过Pull-down及Western Blot实验,证实DOC-1R分别与CK2α及PRDX1蛋白结合,同时我们在洗脱物中应用CK2β抗体检测到了CK2β的存在。2 Co-Ip实验证明DOC-1R分别与CK2α及PRDX1相互作用通过Co-Ip和Western Blot实验,检测可知DOC-1R分别与CK2α及PRDX1蛋白存在相互作用。3构建缺失型DOC-1R原核表达载体并诱导表达重组蛋白以分别初步确定DOC-1R与CK2α及PRDX1蛋白结合的关键区域截短的DOC-1R片段已经成功插入pGEX-5X-1载体中,目的片段序列正确且开放阅读框架完整,截短的DOC-1RdelN42、DOC-1RdelC42、DOC-1RdelN63在37℃诱导3 h时均大量表达。DOC-1R第107-119位氨基酸区域结合CK2α蛋白,且DOC-1R第85-126位氨基酸区域结合PRDX1蛋白。结论:1.应用GST Pull-Down和Co-Ip技术证实DOC-1R分别与CK2α及PRDX1相互结合。2.应用重组技术及GST Pull-Down技术证明,DOC-1R与CK2α结合区域在DOC-1R的第107-119位氨基酸区域,DOC-1R与PRDX1蛋白的结合区域在DOC-1R的第85-126位氨基酸区域。