【研究背景】　　乳腺癌是影响全球女性最普遍的癌症之一,其远处转移引起显著的病死率。据统计，2015年美国报告的女性浸润性乳腺癌病例数为231840例，其中40290例死亡。在乳腺癌的继发性转移灶中，大约有70％发生骨转移。乳腺癌转移形成可见的转移性骨病变，其过程包括乳腺癌细胞优先转移到骨组织，导致溶骨性病变;其中乳腺癌细胞经历包括招募到骨组织，在骨微环境中的存活和克隆扩张，以及破骨细胞激活和吸收骨组织等。越来越多证据表明原位乳腺癌细胞中骨重塑基因异常表达会增加骨转移的风险。同时，近年来，研究结果表明具有自我更新和再生肿瘤能力的乳腺癌干细胞（BCSCs）是导致乳腺癌远处转移和复发，以及放化疗耐药的最主要的原因。然而，其潜在的分子机制在很大程度上是未知的。　　Runx2是一种转录因子，是Runt基因家族的成员之一，在成骨细胞和骨发育中起着关键作用。它通过结合成骨细胞特异顺式作用元件2（OSE2）调控几种与骨基质重建有关基因的表达。在乳腺癌细胞中，Runx2参与调控与骨转移有关的基因如bsp、opn、mmp-9和mmp-13。Runx2及其靶基因在乳腺癌组织中高度表达，并且在乳腺癌骨转移中起着重要作用。在正常上皮细胞中，Runx2能够与DNA相互结合。同时，Runx2也参与催乳素作用的乳腺泌乳过程。正常人乳腺上皮细胞（MCF-10A）在Runx2诱导后获得了肿瘤表型。目前大多数的机制研究结果表明Runx2通过促进肿瘤细胞与骨微环境之间的相互作用，导致溶骨性转移性疾病。但是Runx2是否能够调节在乳腺癌发生转移中起重要作用的BCSCs尚未有报道。　　恶性肿瘤常见的特征，即上皮性状的丧失和细胞通过上皮-间质转化EMT过程获得的某些间质细胞性状已得到广泛的证实。多种信号通路参与EMT的发生，其中TGF-β信号通路是广泛认可在EMT发生中起着重要的作用。EMT过程涉及产生干细胞样肿瘤起始细胞，癌细胞的播散，转移和放化疗耐药。一些证据显示，CSCs是表型不同的细胞类型，具有无限增殖潜力和再生肿瘤的能力。而在乳腺癌中，这些细胞通常有发生EMT的特征。此外，乳腺癌中发生EMT阶段与肿瘤干细胞特性有关，如自我更新能力，抵抗常规疗法和治疗后复发。研究还表明EMT可能促进干性的获得和维持以及启动血管生成拟态（VM）。因此我们猜想Runx2是否能够影响BCSCs的生物学功能，而这其中是否是通过EMT来发挥作用的。　　本课题中，首先检测了高低表达Runx2对乳腺癌细胞MB-231和MCF-7等生物学行为的影响。通过体外实验检测上调或下调Runx2表达对BCSCs标志物CD44的表达水平和微球体形成的影响以及体内裸鼠成瘤实验抑制Runx2的表达，检测对BCSCs免疫缺陷小鼠高致瘤性的影响。并通过检测EMT相关蛋白的表达探讨Runx2是否通过促进EMT的发生，从而来影响乳腺癌干细胞的比例。通过探讨Runx2在乳腺癌干细胞中的作用，为临床根除乳腺癌提供了新方向。　　【研究目的】　　探讨Runx2对乳腺癌恶性表型的影响并探讨其分子机制。　　【研究内容】　　Runx2对乳腺癌干细胞的生物学作用以及Runx2调节BCSCS的机制。　　实验室前期的研究结果已表明Runx2和乳腺癌干细胞标志物CD44的表达在乳腺癌细胞株和人乳腺癌组织标本中呈现相关性。　　1.用上调Runx2表达的慢病毒感染MCF-7乳腺癌细胞，用下调Runx2表达的慢病毒感染MB-231乳腺癌细胞，嘌呤霉素筛选建立稳定表达GFP荧光的MCF-7细胞和MB-231细胞。　　2.用RT-PCR和Western blot检测慢病毒感染的乳腺癌MB-231细胞和MCF-7细胞中，Runx2的表达情况。　　3.用上述构建好的细胞株来研究Runx2在乳腺癌细胞中的生物学功能。　　（1）MTT法检测Runx2对乳腺癌细胞MB-231和MCF-7活力的影响。　　（2）平板克隆实验检测Runx2对乳腺癌细胞MB-231和MCF-7的克隆形成能力的影响;软琼脂集落形成实验检测Runx2对乳腺癌细胞MB-231和MCF-7非锚定生长能力的影响。　　（3）Transwell法检测Runx2对乳腺癌细胞MB-231和MCF-7侵袭能力的影响。　　4.Western Blot实验检测上调或下调Runx2表达对BCSCs标志物CD44的表达水平和干细胞微球体形成的影响以及体内裸鼠成瘤实验检测抑制Runx2的表达，检测其对BCSCs高致瘤性的影响。　　5.用Western blot检测Runx2对EMT相关marker的蛋白表达的影响。　　【研究结果】　　1.成功构建了敲低Runx2表达的MB-231和过表达Runx2的MCF-7稳定细胞株。　　2.Runx2对乳腺癌细胞活力的影响：MTT结果显示，在MB-231中敲低Runx2的表达后，细胞活力明显下降;而MCF-7中过表达Runx2后，细胞的活力明显增加。　　3.Runx2对乳腺癌细胞克隆形成能力和非锚定生长能力的影响：平板克隆结果显示，在MB-231中低表达Runx2后，克隆形成的大小和数目明显减少，软琼脂的集落形成大小和数目也都明显减少，表明抑制Runx2能够抑制乳腺癌细胞的克隆形成能力和非锚定生长能力。在MCF-7中过表达Runx2后，克隆形成的大小和数目明显增加，软琼脂的集落形成大小和数目也都明显增加，表明Runx2能够促进乳腺癌细胞的克隆形成能力和非锚定生长能力。　　4.Runx2对乳腺癌细胞侵袭能力的影响：Tranwell结果表明，在MB-231中敲低Runx2的表达后，细胞的侵袭能力降低;而在MCF-7中过表达Runx2后，细胞的侵袭能力明显增加。以上结果表明了Runx2能够促进乳腺癌细胞的侵袭能力。　　5.Runx2过表达增加BCSCS标志物CD44的表达和微球体形成的数目和体积，敲低Runx2的表达能够抑制BCSCS对免疫缺陷小鼠的高致瘤性。　　6.Runx2与EMT的关系：通过WB检测发现，敲低Runx2表达，MB-231中间质样Marker的表达降低，而上皮样Marker表达升高;过表达Runx2，MCF-7中间质样Marker的表达增加，而上皮样Marker表达下降。　　【结论】　　在乳腺癌细胞中下调Runx2的表达，能够抑制乳腺癌干细胞的活力、侵袭、克隆形成能力和体内裸鼠成瘤能力，同时能够抑制EMT的发生;而上调Runx2的表达，能够促进乳腺癌的恶性表型，表明Runx2增加BCSCS的比例是通过诱导EMT的发生使癌细胞向BCSCS转化而发挥作用的。