第一部分 SD大鼠MSCs、ECs的培养 目的:体外培养SD大鼠的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells MSCs)、主动脉内皮细胞(Endothelial Cells ECs)，为测定共培养细胞的增殖和MSCs的分化作准备。 方法：MSCs的培养：无菌条件下取SD大鼠的股骨与胫骨，应用PBS冲洗骨髓腔，将细胞混悬液以(3-5)×10<6>/瓶的密度接种到75cm<2>的培养瓶中，采取全骨髓贴壁法培养SD大鼠的原代MSCs。48小时首次换液，将悬浮未贴壁细胞去掉。以后每三日换液一次，10-14天细胞生长达融合状态时，应用0.25％胰蛋白酶+0.01％EDTA进行消化，以1：2的比例进行传代。通过换液与传代纯化MSCs。应用流式细胞仪对P3代MSCs的CD34、CD90进行鉴定。ECs的培养：无菌条件下取SD大鼠的胸主动脉，清除血管外结缔组织，将其剪成厚约1.5mm的血管环。以15-20个血管环/瓶的密度接种于25am<2>的培养瓶中，以20％胎牛血清的DMEM进行培养。静止培养60小时后首次换液去掉血管环，6-8天细胞达单层融合时应用0.25％胰蛋白酶+0.01％EDTA进行消化，以1：2的比例进行传代培养。应用ABC法对P3代细胞的Ⅷ因子进行鉴定。 结果:MSCs原代培养48小时换液后，可见少量细胞贴壁生长，呈集落样分布于培养瓶底部。换液后细胞呈纺锤形、长梭形生长。10-14天时，细胞呈成纤维状铺满瓶底。传代细胞生长加快，6-8天既可达单层融合状态。P3代细胞经流式细胞仪鉴定，CD34表达率为0.21％，CD90表达率为96.7％；ECs原代培养60小时后，细胞呈集落样散在分布于培养瓶底部，6-8天即可达融合状态，此时细胞呈现典型的‘铺路石样’形态。传代细胞3天即可达单层融合状态，P3代细胞经ABC法鉴定其阳性率可达95％以上。 结论:实验所采用的细胞培养方法可行，细胞纯度能够达到实验应用的要求。 第二部分共培养体系的建立和细胞增殖与分化的测定 目的:探讨MSCs对联合培养细胞增殖及自身表达平滑肌肌动蛋白(smooth muscle alpha-actinα-actin SM)的影响。 方法:(1)建立MSCs和ECs增殖共培养体系：对P3-P5代的MSCs与ECs进行消化离心，去除上清后加入适量培养基将细胞吹打混匀，应用细胞计数板进行细胞计数。单纯MSCs培养组以10000个细胞/孔加入24孔板中，共培养组MSCs与ECs以9000：1000个细胞/孔的比例加入24孔板中，分别在1、2、3、4天对培养的细胞消化计数。每组每时间点计数6孔，实验重复3次。(2)建立MSCs和ECs分化共培养体系：对P3-P5代的MSCs与ECs进行消化离心，MSCs去掉上清后加入1ml培养基，吹打混匀，然后避光加入5ng的DAPI(46-diamidino-2-phenylindole 2hei 46-二乙酰基-2-苯基吲哚)，37℃避光孵育30min。单纯MSCs培养组以10000个细胞/孔加入24孔板中，共培养组MSCs与ECs以9000：1000个细且包/孔的比例加入24孔板中，孔底置盖玻片，避光培养5天，利用抗α-actin SM荧光抗体，采用免疫组化方法检测两组中MSCs胞浆内α-actin SM的表达。 结果:(1)共培养组细胞计数较单独MSCs培养组减少，但两组没有统计学差异(P>0.05)(2)单纯MSCs培养组α-actin SM的阳性表达率为44.1％，共培养组MSCs表达α-actin SM的阳性率为23.6％，两组间有统计学差异(P<0.05)。 结论:(1)MSCs与ECs具有兼容性，能够进行直接共培养，且共培养对MSCs的增殖无明显影响。(2)MSCs本身即可表达α-actin SM，与ECs共培养后α-actin SM表达受到抑制，表明与ECs共培养后可抑制MSCs向平滑肌样细胞分化。 第三部分 Ox-LDL与TGFβ1对共培养的骨髓MSCs增殖和分化的影响 目的:探讨氧化型低密度脂蛋白(Oxiddized low density lipoprotein Ox-LDL)转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1 TGFβ1)对与ECs共培养体系中MSCs增殖和向平滑肌样细胞(Smooth Muscle CeHs SMCs)方向分化的影响。 方法:对P3-P5代的MSCs与ECs进行消化离心，MSCs去掉上清后加人1ml培养基，吹打混匀，然后避光加入 5ng的DAPI，37℃避光孵育30min。将MSCs与ECs以9000：1000个细胞/孔的比例加入内置盖玻片的24孔板中，试验分三组：单纯共培养组，不加干预因素；Ox-LDL干预组以5ug/mlOx-LDL进行干预；TGFβ1干预组以5ng/ml的TGFβ1进行干预。共培养细胞避光培养5天，利用抗α-actin SM荧光抗体，采用免疫组化方法检测三组中MSCs胞浆内α-actin SM的表达。利用Leica Qwin软件，在荧光显微镜高倍视野下计数每组中DAPI标记的细胞核数，测定细胞增殖情况。 结果:(1)MSCs的α-actin SM的表达Ox-LDL(5ug/ml)干预组MSCs表达α-actin SM的阳性率约为9.9％，TGFl31(5ng/ml)干预组MSCs表达(α-actin SM的阳性率约为36.7％，在未干预组，MSCs表达α-actin SM的阳性率约为23.60％，干预组与对照组相比均P<0.05，具有统计学意义。(2)未干预组细胞数为67.80±21.45/高倍视野，Ox-LDL(5ug/ml)干预组细胞数为135.6±39.45/高倍视野，与对照组相比，MSCs细胞数明显增高P<0.05，具有统计学意义；TGFβ1(Sng/ml)干预组MSCs数量为60.00±20.38/高倍视野，与对照组相比，MSCs细胞数虽有所减少，但P>0.05，两组间的增殖无明显差异。 结论：Ox-LDL(5ug/ml)具有促进共培养中MSCs增殖，降低MSCs向平滑肌细胞方向分化，而TGFβ1(Sng/ml)具有促进共培养体系中MSCs向平滑肌方向分化作用。