牛病毒性腹泻病（Bovine viral diarrhea,BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）引起的一种重大传染病,主要感染牛、羊、鹿和猪等动物。该病分布范围广泛,给全世界的畜牧业造成了巨大的经济损失。目前西方有经验的国家主要以灭活疫苗和减毒疫苗来预防该病,而我国针对BVDV的研究起步较晚,疫苗研制相对落后。临床上只有一种灭活疫苗被批准使用,而且其免疫原性较差,免疫成本较高。因此,急需研制出免疫原性高且成本较低的新型疫苗,为我国BVDV防控工作提供新方法。BVDV是一种单股正链RNA病毒,大小约为12.3kb。其开放阅读框编码一个长的多聚蛋白,被病毒和宿主蛋白酶切割成12个成熟的多肽。其中NS5B蛋白位于多聚蛋白的羧基末端,具有RNA依赖性RNA聚合酶活性,对BVDV基因组的复制至关重要。如果缺乏NS5B蛋白,BVDV基因组将无法复制,其在宿主细胞中便无法增殖,从而失去连续感染的能力。因此可以利用该特性构建缺失NS5B的BVDV疫苗株,这将为我国BVDV疫苗研制提供新思路。构建全长感染性cDNA克隆是获得NS5B基因缺失疫苗的必经之路。虽然之前有相关报道,但所有针对BVDV的拯救方法,均需经过体外转录、体外合成和RNA转染等技术,过程繁琐且RNA易降解,对操作技术要求较高。因此需要研发出一种简便易操作的反向遗传系统来拯救BVDV。为了解决上述问题,在本论文中,我们开展了如下研究:（1）为了检测BVDV病毒,我们构建NS5B蛋白的原核表达载体,使用IPTG诱导剂诱导蛋白表达。蛋白经镍柱纯化后,作为主要免疫原,皮下接种刺激小鼠产生免疫反应,从而产生多克隆抗体。研究发现,NS5B蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,且截短的NS5B比未截短的表达量要高。将该多克隆抗体用于检测BVDV,显示特异性较好。（2）构建NS5B慢病毒表达载体,使用电穿孔转染法将其转入BHK细胞中,使用嘌呤霉素进行筛选表达NS5B的阳性单克隆细胞,并逐级扩大培养为稳定表达NS5B蛋白的BHK细胞系。（3）为了方便检测BVDV疫苗的免疫效果,我们构建了BVDV感染小鼠模型。使用口服灌胃法接种野生型BVDV,然后通过Western Blot以及免疫荧光法检测其脾脏内BVDV的表达情况,并通过HE染色观察BVDV对其组织的病理学损伤情况。研究发现,口服接种可以使小鼠感染BVDV,且感染后第五天BVDV表达量最高。有趣的是,感染BVDV对小鼠肝脏、心脏和脾脏组织并无明显病理学损伤。（4）本文对BVDV的反向遗传操作系统进行了简化。基本操作是在其基因组5′UTR前加入锤头状核酶序列,可以使宿主细胞中转录出的RNA能准确地将5′端多余序列切除。在3′UTR后加入丁型肝炎病毒核酶序列,可以确保BVDV 3′端的完整性。经改进后,它可以不经体外转录,直接转染细胞产生BVDV,这使BVDV拯救优于之前报道的系统。随后,将构建好的BVDV感染性RNA表达载体转染至BHK细胞中获得其感染性RNA,即拯救型BVDV。感染MDBK细胞后盲传5代,通过观察细胞病变情况以及PCR检测,确定拯救型BVDV是否呈阳性。进而通过免疫荧光检测以及Western Blot检测等方法分析拯救型BVDV的感染性。经检测后发现,拯救型BVDV呈阳性且具有一定的感染性,但是细胞感染后无明显细胞病变情况,且病毒滴度较低。将其感染小鼠后进行Western Blot检测,发现可以感染小鼠。（5）在BVDV全基因组克隆的基础上,缺失NS5B基因,构建缺失NS5B的BVDV感染性RNA表达载体。本文对BVDV的拯救与分析进行了进一步的研究,并提出构建NS5B缺失疫苗的思路,为拯救BVDV提供新方法,为研制BVDV缺失疫苗株奠定基础,对我国防控BVDV具有重要意义。