背景癌症患者主要的死亡原因仍然是远端转移。一旦进展到转移期,患者的5年生存率就明显下降。癌转移是一个复杂的过程,这其中牵涉了癌细胞从原发肿瘤迁移,进入循环（内渗）,然后在远处器官离开循环（外渗）,最后转移性定植。目前的研究证据支持肿瘤微环境参与了肿瘤的发生、发展、侵袭、转移过程。分泌蛋白是细胞分泌的最重要一类活性物质,能够通过旁分泌或远距分泌对肿瘤微环境进行修饰。SEC23A蛋白参与COPⅡ囊泡的组装,介导大部分分泌蛋白从内质网向细胞内高尔基体的转运,已有相关研究揭示了SEC23A可以通过影响分泌蛋白的分泌,改变肿瘤微环境,从而抑制肿瘤的转移。本课题组前期采用液相色谱-串联质谱技术分析了敲低Sec23a的黑色素瘤细胞培养基中分泌蛋白的改变。与对照组比较,在敲低Sec23a的黑色素瘤细胞中发现28种分泌蛋白明显下降,其中分泌蛋白PF4下降约5倍,而SEC23A与PF4之间相关研究未见报道。本研究在此基础上,利用多种分子生物学技术,观察分泌蛋白PF4对黑色素瘤迁移和侵袭等生物学功能的影响及其相关机制。另外,本研究注意到通过改变Sec23a基因表达,调节蛋白的分泌,影响肿瘤细胞转移是一种效率低下的方式,可能存在Sec23a通过非分泌蛋白途径调控肿瘤细胞转移的方式。在本课题前期研究中,构建出了高、低转移能力不同的异质性黑色素瘤细胞。然而,在微环境的研究中,我们没有关注到高转移异质癌细胞对低转移异质癌细胞的影响,更没有注意到高转移异质癌细胞是否可以通过分泌自身物质对低转移异质癌细胞的Sec23a进行调控,从而促进低转移癌细胞的转移。我们认为细胞排出分泌蛋白和外泌体是影响微环境的两种不同方式。外泌体mi RNAs是目前外泌体研究的热点之一,越来越多的证据显示肿瘤细胞来源的外泌体mi RNAs深刻地影响了肿瘤的发生、发展和转移。高转移异质癌细胞通过分泌蛋白和外泌体联合作用于肿瘤微环境,从而影响低转移异质癌细胞转移方面的研究未见报道。基于此,为了更加深入阐明Sec23a对肿瘤转移的影响以及揭示微环境中的高转移异质癌细胞对低转移异质癌细胞的影响机制,本研究以分泌蛋白、外泌体mi RNA和Sec23a为切入点,观察高转移癌细胞来源的分泌蛋白和外泌体mi RNA对低转移癌细胞Sec23a的影响,从而揭示微环境中不同异质性癌细胞之间的调控机制。第一部分SEC23A通过分泌蛋白PF4与SPARC协同抑制MAPK信号通路抑制黑色素瘤细胞转移目的探讨Sec23a通过分泌蛋白质组调控黑色素瘤细胞转移的分子机制。方法1.利用课题组前期建立的稳定同源的黑色素瘤细胞寡灶型转移（OL）和多灶型转移模型（POL）。2.通过慢病毒感染的方法稳定敲低或过表达目的基因。3.通过体外迁移和侵袭实验结合小鼠尾静脉肿瘤移植实验检测目标基因对黑色素瘤细胞转移的影响。4.通过蛋白质谱检测依赖Sec23a途径的分泌蛋白谱的变化。5.通过拮抗抗体和重组蛋白处理,研究目标分泌蛋白对黑色素瘤细胞转移功能的影响。6.通过生物信息技术筛选目标分泌蛋白调控黑色素瘤转移的可能分子机制,并通过迁移、侵袭和WB实验对机制进行验证。7.通过生物信息学技术筛选目标分泌蛋白的协同因子,并通过迁移、侵袭和WB实验验证协同因子对目标分泌蛋白的影响。结果1.过表达或敲低Sec23a结合转移功能试验,验证了Sec23a在体外具有调控黑色素瘤细胞迁移和侵袭的能力。2.OL细胞内敲低Sec23a改变了OL细胞的分泌蛋白谱,显著抑制了分泌蛋白PF4的分泌,促进了黑色素瘤细胞的迁移、侵袭和增值能力,促进了黑色素瘤细胞体内肿瘤转移形成能力。3.通过敲低Pf4和加入重组PF4蛋白,验证了PF4通过调控MAPK/ERK信号通路阻碍黑色素瘤细胞的迁移和侵袭。4.分泌蛋白SPARC通过与PF4协同的作用在体外抑制了黑色素瘤细胞的转移行为。结论本研究阐明了“SEC23A-PF4-MAPK/ERK轴”抑制黑色素瘤的新机制,其中分泌蛋白PF4由COPII转运通过抑制MAPK/ERK信号通路阻碍转移。此外,分泌蛋白SPARC可以协同增强PF4对ERK磷酸化和黑色素瘤细胞转移的抑制作用。第二部分高转移异质性癌细胞通过调控SEC23A和mi RNA-487a-5p协同抑制NUDT21促进低转移异质性癌细胞的转移目的探讨微环境中高转移黑色素瘤细胞通过联合分泌蛋白和外泌体mi RNA协同调控低转移黑色素瘤细胞转移的分子机制。方法1.利用课题组前期建立的黑色素瘤细胞寡灶型转移（OL）和多灶型转移模型（POL）模拟微环境中转移能力不同的两种异质性细胞。2.建立共培养体系结合迁移和侵袭实验,观察POL细胞对OL细胞转移的影响。3.通过PCR和WB检测POL细胞来源的分泌蛋白对OL细胞Sec23a基因表达的影响;并通过生物信息学技术挖掘Sec23a上游调控分泌因子。4.通过电镜、WB和粒径仪对POL和OL细胞来源的外泌体进行鉴定,以及观察POL细胞外泌体对OL细胞的影响;通过PCR和WB检测POL细胞来源的外泌体对OL细胞Sec23a的影响。5.由于本研究只观察到POL细胞来源的分泌蛋白对Sec23a具有调控作用,而没有观察到POL细胞外泌体对Sec23a的影响。因此,在原有设计思路上面,本部分把研究思路调整为Sec23a与外泌体mi RNAs协同作用一个靶点促进OL细胞的转移。6.通过生物信息学技术对POL和OL细胞来源的外泌体内含物测序数据进行表达差异分析,筛选目标外泌体mi RNA,并观察该外泌体mi RNA对OL细胞转移的影响。7.通过体外迁移和侵袭实验结合小鼠尾静脉肿瘤移植实验检测目标因子对黑色素瘤细胞转移的影响。8.通过在线mi RNA数据库结合LASSO机器学习筛选外泌体mi RNA下游靶基因;利用Pearson分析Sec23a与外泌体mi RNA下游靶基因相关性,筛选出Sec23a与外泌体mi RNA共同下游调控因子,结合PCR和WB实验验证该因子为共同下游因子,并通过体内、外功能实验验证该因子对黑色素瘤细胞转移的影响。9.通过生物信息学技术分析原发灶和转移灶中糖酵解基因的差异;使用质谱检测POL和OL细胞糖酵解中间产物的变化。10.过表达目标基因,观察其对细胞内葡萄糖、ATP和乳酸含量的影响,以及使用糖酵解抑制确认糖酵解对黑色素瘤细胞转移的影响。结果1.使用POL与OL细胞共培养实验,验证了POL细胞可以通过外排自身物质促进OL细胞的转移。2.收集POL细来源外泌体处理OL细胞,验证了POL细胞来源的外泌体具有促进OL细胞的能力。3.验证了POL细胞来源的分泌蛋白通过抑制OL细胞内Sec23a基因表达,从而促进OL细胞的转移,而非POL细胞外泌体途径对Sec23a的调控。4.通过对POL和OL细胞的外泌体内容物二代测序数据分析,筛选到差异mi R-487a-5p,并通过迁移和侵袭结合体内实验,确认了mi R-487a-5p在体内、外具有促进OL细胞转移的能力。5.通过mi RNA数据库与机器算法结合的方法,筛选到Sec23a和mi R-487a-5p共同下游调控因子Nudt21;并通过PCR检测和迁移侵袭实验,验证了Sec23a和mi R-487a-5p对Nudt21具有协同调控作用。6.过表达Nudt21在体内和体外具有抑制黑色素瘤细胞的转移能力;同时过表达Nudt21抑制了黑色素瘤细胞内葡萄糖、ATP和乳酸的含量,抑制了细胞糖酵解过程,从而抑制了黑色素瘤的转移。7.使用生物信息学技术结合“Sec23a-Nudt21轴”与分泌质谱数据筛选到Sec23a上游调控分泌因子S100A11,并通过PCR、WB和功能实验,验证S100A11为Sec23a上游因子。结论POL细胞通过联合“分泌蛋白S100A11—Sec23a途径”和“外泌体—mi R-487a-5p途径”两种方式协同作用于NUDT21,抑制黑色素瘤细胞糖酵解过程,介导低转移异质性癌细胞向高转移异质性癌细胞转变。