鲤鱼肝胰脏cDNA文库构建、EST分析及脂肪酸结合蛋白样基因的初步研究

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本文通过构建鲤鱼(Cyprinus carpio)肝胰脏cDNA文库、表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)分析以及对脂肪酸结合蛋白样基因的初步研究,旨在深入了解鲤鱼脂类代谢的相关功能及机制。cDNA质粒文库构建采用了Gateway技术,经检测,文库的平均滴度(Titer)为1.193×10<6> cfu/ml,文库总菌落形成单位(CFUs)为1.432×10<7> cfu。随机挑选1074个cDNA文库阳性单克隆进行5单向测序,共获得了1016条有效的ESTs,平均长度约为792bp。运用生物信息分析软件DNAStar进行质检和拼接组装为基因重叠群(Contig),共获得397条有效的一致序列(Consensuses)序列。其中115个contigs包含2条以上的EST序列,其余282个仅含有一条EST(Singleton)。基于GenBank非冗余公共数据库等的EST分析系统结果显示,397条consensuses中共有215条(54.15﹪)与GenBank非冗余数据库的已知功能蛋白基因具有较高同源性。122条(30.73﹪)序列类似于功能未知的ESTs和cosmid序列;60条(15.11﹪)在GenBank中找不到任何相似的序列。与已知功能蛋白编码序列有较高的同源性的215条consensuses(共包含721条ESTs),依据功能分为3大类,181条consensuses蛋白编码序列(包括540条ESTs)属于结构蛋白和酶类等看家基因归属为A类;25条consensuses蛋白编码序列(包括156条ESTs)属于B类,执行细胞与细胞通讯的功能;C类9条consensuses蛋白编码序列(包括25条ESTs)属于转录因子和其他调节蛋白。通过EST聚类拼接得到两条具有完整开放阅读框的肝基本型脂肪酸结合蛋白样(Liver basic fatty acid binding protein—like,Lb-FABP—like)cDNA序列,fabp10a-like、fabp10b-like cDNA序列分别长507bp、517bp,开放阅读框都为381bp,编码126个氨基酸,无信号肽。氨基酸序列同源性分析表明,鲤鱼FABP10-like A和FABP10-like B与斑马鱼(Danio rerio)FABP10同源相似性最高,与哺乳动物肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)同源性较低。进化树分析表明,鲤鱼FABP10-likeA和FABP10-like B与斑马鱼、两栖类、爬行类、鸟类的Lb—FABP在同一进化支上,区别于另一类肝型L-FABP。成体组织分布结果显示,鲤鱼fabp10-like mRNA在肝胰脏、中肠、后肠表达丰富,其它组织除脂肪和前肠外都有微量表达。胚胎及幼体发育各期表达检测结果显示,fabp10-like mRNA最早在胚体形成期开始有表达,随后表达量逐渐上升。出膜后的仔鱼FABP10-like都有明显表达。fabp10-like mRNA表达检测结果提示:随着鲤鱼胚胎发育逐步形成肝胰脏及肠后,FABP10-like可能在肝胰脏、肠内参与细胞内脂肪酸运输、促进脂肪酸吸收等方面起到了重要作用。
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