研究背景:尽管临床介入治疗，药物治疗及预防策略的不断进展，心脏病仍是全球导致死亡的最危险疾病。其中缺血性心脏病是导致心衰死亡的主要原因。干细胞移植能够从结构上修复受损的心脏，从而恢复心脏功能，预防或逆转心衰的发生，为急性心肌梗死(AMI)的治疗带来新的希望。尽管许多研究表明(1;2)，骨髓间充质干细胞(MSCs)在AMI中能促进心肌的修复，改善心功能。但其为转分化，融合或旁分泌效应，机制尚不明确。目前更多的研究集中在识别心脏本身的干细胞(CSCs)和促使它们增殖和迁移的因子，但自体CSCs由于来源有限，取材和扩增困难及自身条件的限制不能适应心肌梗死急诊治疗的要求。同种异体心脏干细胞移植能解决这一难题，但其存在的最大障碍是移植排斥反应，移植可能诱导的炎症反应受到极大的关注，炎症因子能够上调主要组织相容性复合体(MHC)在移植细胞的表达，导致细胞更易受到移植排斥。血红素氧化酶-1(HO-1)具有抗炎及抗凋亡的特性，研究表明其在同种异体器官移植中具有重要的保护作用，已有研究表明HO-1在MSCs的免疫调节中发挥重要作用(3;4)。本研究假设HO-1在同种异体心脏干细胞移植后的免疫网络中起着关键作用，通过调节MHC的表达，减低免疫排斥反应，增加移植细胞的存活，从而达到改善心功能的目的。　　 第一部分心脏干细胞表面主要组织相容性复合体表达的研究　　 目的:主要组织相容性复合体是指编码主要组织相容性抗原的一组紧密连锁的基因群，与特异性免疫应答密切相关。MHC-Ⅰ类分子及MHC-Ⅱ类分子在机体识别自身，抗原处理、提呈通路在调控CD4+T细胞激活及特异性应答的过程中发挥重要的作用，T细胞的功能在很大程度上取决于MHC-Ⅱ类分子的表达水平，但研究表明干细胞表达低水平的MHC-Ⅰ类分子及不表达MHC-Ⅱ类分子。本研究明确CSCs及MSCs表面MHC-Ⅰ类分子及Ⅱ类分子的表达。资料与方法:CSCs来源于C57BL/6小鼠的心脏，心脏组织经酶消化贴壁培养，游离出心脏成纤维细胞及圆形发亮的干细胞，经过干细胞标志Ckit(CD117)磁珠筛选获得Ckit+CSC。同时获得小鼠四肢骨，经研磨，过滤，全骨髓法培养MSCs，传代2次后，经过bio-CD45磁珠分选，获得CD45阴性的MSC。脾细胞通过研磨脾脏，Ficoll-paque密度梯度离心法获得脾细胞。通过流式细胞仪分析CSCs及MSCs的表面标志，real-timeRT-PCR及WesternBlot从mRNA及蛋白水平观察CSCs及MSCs表面MHCⅠ类及Ⅱ类分子的表达水平。结果:流式细胞检测表明CSC及MSC均为Sca1+细胞群。RT-PCR从mRNA水平证实CSC为GATA4阳性的细胞，跟脾细胞相比，CSC及MSC均低水平表达MHC-Ⅰ类分子，几乎不表达MHC-Ⅱ类分子。CSC与MSC相比MHC-Ⅰ类分子表达水平更低。结论:经两步法培养获得的CSC为Ckit+/Sca1+细胞群，且高表达GATA4。体外培养中MSC及CSC均表达低水平的MHCⅠ类分子，缺乏MHC-Ⅱ类分子，表现为较低的免疫源性。　　 第二部分炎症环境下心脏干细胞表面主要组织相容性复合体表达的改变　　 目的:干细胞移植成为缺血性心脏病的潜在治疗方法，细胞移植诱导的炎症反应正受到越来越多的关注，炎症因子能够上调主要组织相容性复合体的表达，从而使移植细胞更易发生移植排斥。本研究观察炎症因子干扰素-γ对心脏干细胞表面MHC-Ⅰ类及Ⅱ类分子表达的影响及其调控机制。资料与方法:通过从C57BL/6小鼠的心脏，骨髓分离、培养获取心脏干细胞及骨髓间充质干细胞，干扰素-γ(25ng/ml)治疗后24小时，收集RNA及蛋白，从mRNA及蛋白水平观察MHCⅠ类分子，Tapsin，MHC-Ⅱ类分子及其主要调控转录因子Ⅱ类反式激活蛋白(classⅡtrans-activator，CⅡTA)的改变。为证实CⅡTA在干扰素-γ诱导MHC表达中的作用，获取CⅡTA基因敲除的转基因小鼠心脏，培养心脏干细胞，RT-PCR证实其不表达MHC-Ⅱ，并且干扰素-γ治疗后不能诱导MHC-Ⅱ的表达，但CⅡTA基因敲除对MHC-Ⅰ类分子的表达没有显著影响。建立小鼠急性心肌梗死模型，观察急性心肌梗死后1天，3天，5天干扰素-γ的变化，直接经心肌注射心脏干细胞及骨髓间充质干细胞观察自体移植及同种异体移植在心肌梗死区所诱导的干扰素-γ，IL-10的水平变化，同时通过GFP表达水平比较MSC及CSC在移植区的存活。结果:RT-PCR证实IFN-γ治疗后MSCsmRNA水平H2Kb，H2Db，Tapasin分别增加了6.73，10.3及4.67倍，MHC-Ⅱ表达增加了21.24倍，CⅡTA增加了147.37倍。CSCsH2Kb，H2Db，Tapsin分别增加了5.54，3.53及6.34倍。MHC-Ⅱ表达增加了104.35倍，CⅡTA增加了222.65倍。在CⅡTA基因敲除的CSC，干扰素-γ治疗后MHC-Ⅱ类分子的表达没有明显变化。WesternBlot及流式细胞检测亦从蛋白水平证实干扰素-γ刺激增加了MHC-Ⅰ类分子及MHC-Ⅱ类分子的表达。小鼠急性心肌梗死模型证实心肌梗死后及自体干细胞移植干扰素-γ水平没有明显变化，但同种异体心脏干细胞移植明显增加了干扰素-γ的水平，降低了CSCs在缺血梗死区的存活率。　　 结论:IFN-γ能增加MSC及CSCMHC-Ⅰ类分子及MHC-Ⅱ类分子的表达，通过CⅡTA从转录水平精细调节MHC-Ⅱ的表达。同种异体心脏干细胞移植后能诱导炎症反应，从而加重免疫排斥。　　 第三部分:血红素氧化酶-1通过CⅡTA精细调节MHC-Ⅱ的表达　　 目的:血红素氧化酶-1(HO-1)是细胞的一种内源性保护蛋白，其水平在应激情况下（包括氧化应激、炎症因子）会上调，具有抗缺血再灌注损伤和低氧损伤的功能，在缺血环境中具有细胞保护活性。本研究探讨HO-1在同种异体心脏干细胞移植免疫排斥中的保护作用。　　 资料及方法:为了研究HO-1对心脏干细胞MHC表达的影响，通过慢病毒包装HO-1质粒获得过表达HO-1的CSCs及siRNA干扰技术下调CSCs的HO-1水平，并且模拟移植后的炎症环境，利用干扰素-γ（IFN-γ，25ng/ml）刺激CSCs，Lenti-HO-1-CSCs及siRNA-HO-1-CSCs24小时，通过RT-PCR从mRNA水平评价HO-1在正常环境下及炎症环境下对MHC-Ⅰ类分子及MHC-Ⅱ类分子的影响及其调节机制。为了研究HO-1对IFN-γ调节MHC-Ⅱ表达机制的影响，通过RT-PCR从mRNA水平证实CⅡTA表达的改变，明确HO-1对MHC-Ⅱ类分子在转录水平的调节。　　 实验结果:慢病毒转染成功构建了HO-1高表达的CSCs及siRNA干扰技术下调HO-1表达的CSCs。RT-PCR及WesternBlot从mRNA及蛋白水平证实了HO-1的转染效率。WesternBlot从蛋白水平证实过表达HO-1的CSCs，其HO-1表达较正常CSCs增加了8.35倍，siRNA-HO-1-CSCs其HO-1水平较正常下调了0.71倍。进一步RT-PCR从mRNA水平证实HO-1修饰的CSCsH2Kb,H2Db，Tapsin，MHC-Ⅱ分别下降了-2.30，-2.21，-3.35及-6.77倍，siRNA靶向敲除的CSCsH2Kb，H2Db，Tapasin，MHC-Ⅱ分别增加了1.13，2.14，3.4及2.99倍。在同样IFN-γ刺激条件下，HO-1-CSC比CSCH2Kb，H2Db，Tapasin，MHC-Ⅱ分别下降了-3.48，-3.79，-4.88，-13.78倍。继而RT-PCR检测证实过表达HO-1增加了CⅡTA水平，下调HO-1在CSC的表达随之CⅡTA的水平亦下降。结论:HO-1能影响正常及炎症环境下CSC表面MHC的表达。过表达HO-1能减少MHCⅠ类分子及MHC-Ⅱ类分子的表达，通过CⅡTA从转录水平精细调节干扰素-γ诱导MHC-Ⅱ类分子的表达的通路，减少免疫排斥，从而增加移植细胞的存活，改善心功能。