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研究背景:糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)的发病率在全世界范围内正在逐年升高。DN已经成为欧美诱导终末期肾衰竭需要肾替代治疗的最常见的原因。早期DN的主要特征为小球肥大和进行性细胞外基质(extracellular matrix, ECM)增加,损害逐渐加重和持续性蛋白尿导致肾小球硬化,肾功能恶化和慢性肾功能衰竭。.小球肥大和ECM积聚的分子机制涉及到多种因素和途径,是目前研究的热点。NG2是一种重要的硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycan, CSPG),分子结构显示NG2具有完整的跨膜结构,可与胞外多种配体结合,并介导胞内信号转导,因此在调节细胞与细胞,细胞与ECM的相互作用中发挥了重要的功能。近年来研究者们发现NG2不仅表达在中枢神经系统(central nervous system, CNS),许多间叶细胞中也发现NG2的表达,如成软骨细胞、骨骼肌成肌细胞、表皮干细胞、血管平滑肌细胞/周细胞以及黑色素瘤细胞等。但NG2在肾脏组织中的表达、定位以及功能仍未见报道。目的:本课题旨在观察NG2在大鼠肾脏中的表达和定位,以及NG2在糖尿病大鼠模型中的表达变化,探讨NG2与DN肾小球肥大和ECM积聚之间的关系,从而为DN的发病机制提供新的理论,并为DN的早期防治提供新的作用靶点。方法:(1)雄性SD大鼠麻醉后,灌注固定,取肾脏皮质,免疫荧光法和免疫电镜法观察NG2在大鼠肾脏组织中的定位。取新鲜的肾脏皮质,RT-PCR法和western blot法分别检测NG2 mRNA和蛋白的表达。(2)链脲佐菌素(Streptozocin, STZ)65 mg/kg单次腹腔注射,复制糖尿病大鼠模型,分别于2、4、8周各处死6只。观察肾脏组织病理学和生化指标改变。取肾脏皮质,免疫荧光染色,荧光定量PCR法和western blot法观察NG2表达的变化(。3)体外培养大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1,高糖(30mmol/L)刺激24 hs后观察NG2表达的变化。构建两条针对NG2的shRNA真核表达载体Pgenesil-siNG21和Pgenesil-siNG22,检测干扰效率,取效率高的质粒进行后续实验。(4)将Pgenesil-siNG2和NG2表达载体(pcDNA-NG2)转染入HBZY-1细胞,MTT法观察细胞增殖情况,流式细胞仪(flow cytometry, FCM)检测细胞周期,荧光定量PCR法观察ECM成分collagen VI和Laminin的表达变化。结果:(1)共聚焦显微镜和免疫电镜观察均发现正常大鼠肾脏中可见NG2的表达,主要定位于肾小球系膜区,包括系膜细胞和系膜基质。RT-PCR法和western blot法分别检测NG2 mRNA和蛋白的表达,结果提示正常大鼠肾脏中NG2表达水平较低。(2)STZ腹腔注射3天后,大鼠血糖>16.7mmol/L,视为达到糖尿病诊断标准,且在处死前的8周内始终维持高血糖水平。糖尿病大鼠的血糖、肾重/体重和尿白蛋白/肌酐明显高于对照组,有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。8周糖尿病大鼠可见明显的肾小球肥大和系膜区增生,平均肾小球体积为(1.29±0.11)x106μm3,与对照组(1.14±0.12)x106μm3相比,有统计学意义(P<0.05);电镜显示糖尿病组大鼠部分足突融合,中度系膜基质增生。免疫荧光染色显示糖尿病大鼠NG2表达也定位于系膜区,但较正常组荧光强度增加;荧光定量PCR和western blot结果显示糖尿病大鼠NG2 mRNA和蛋白表达增高。与对应时间段对照大鼠相比,2周糖尿病大鼠NG2 mRNA水平显著增高(138±76)% ,达到峰值;4周和8周糖尿病大鼠也分别增高(74±40)%和(73±37)%。(3)高糖(30mmol/L)刺激HBZY-1细胞24 hs后,NG2表达水平较正常对照组和甘露醇对照组明显升高,有统计学意义(P<0.01)。构建两条针对NG2的shRNA ( Pgenesil-siNG21和Pgenesil-siNG22 ),以及随机阴性对照Pgenesil-siNC,经酶切鉴定和DNA测序均符合设计要求。荧光定量PCR结果显示Pgenesil-siNG21和Pgenesil-siNG22对HBZY-1细胞中NG2基因的抑制率分别为54%和72%,选取Pgenesil-siNG22做后续实验。(4)将Pgenesil-siNG22、Pgenesil-siNC、NG2表达质粒(pcDNA-NG2)和空质粒pcDNA分别转染入HBZY-1细胞,MTT法检测结果显示质粒pcDNA-NG2转染组细胞吸光度值(1.309±0.018)较对照组pcDNA转染组(1.016±0.031)明显增加,有显著统计学意义(P<0.01);而质粒Pgenesil-siNG22转染组细胞吸光度值(0.835±0.038)较对照组Pgenesil-siNC转染组(1.021±0.049)明显下降,有统计学意义(P<0.05),提示NG2基因对HBZY-1细胞有促进增殖的作用。FCM结果显示质粒pcDNA-NG2转染组和Pgenesil-siNG22转染组细胞周期中位于S期的比例分别为17.66%和2.88%,较对照组(10.46%和10.47%)有统计学意义(P<0.05)。荧光定量PCR法结果显示质粒pcDNA-NG2转染组细胞α2 (VI) collagen和Lamininβ1 mRNA表达较对照组明显升高,有统计学意义(P<0.05);而质粒Pgenesil-siNG22转染组细胞α2 (VI) collagen和Lamininβ1 mRNA表达较对照组显著减少,有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:(1)NG2在大鼠肾脏中有表达,主要定位于肾小球系膜区,包括系膜细胞和系膜基质。(2)糖尿病大鼠肾脏NG2表达明显增加,并有时序性改变,2周时达到高峰,后维持较高水平至观察的第8周。(3)体外高糖刺激肾小球系膜细胞可见NG2表达的升高。从沉默和过表达NG2两方面的实验观察发现,NG2基因有促进系膜细胞增殖和ECM成分collagen VI和Laminin增生的作用。(4)因此,NG2可能是参与DN发生进展的重要因子。本课题为DN发病机制的研究提供了新的理论,为DN的早期防治提供了新的作用靶点。