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锌指蛋白家族为真核生物中转录因子家族的一员,其包含多个亚家族。ZBTB(Zinc finger and BTB domain-containing protein)属于锌指蛋白家族的 POK(POZ and Kruppel)家族。研究者最早在树突状细胞中确认ZBTB20的存在,它属于ZBTB家族的新成员,也称为DPZF、HOF或ZNF288。以往的研究证明ZBTB20在很多生理过程中起到重要的作用,如生长发育、免疫调节、血糖调控、痛觉调制等。ZBTB20基因被认为是一种肿瘤相关基因,但在不同报道中其对肿瘤的作用不一致。在非小细胞肺癌、肝癌中,ZBTB20的表达明显上调,且ZBTB20的表达量与患者的预后存在明显的负相关,显示ZBTB20具有促癌基因的作用。但在PTEN基因相关的抑癌基因筛选中,发现ZBTB20具有抑癌作用。在神经胶质瘤细胞中,ZBTB20基因敲减抑制细胞增殖,提示其促癌作用,而ZBTB20敲入则被证明引起胶质细胞分化成熟标志神经胶质纤维性酸蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达增高,显示ZBTB20对分化的促进作用。然而,在神经肿瘤中,ZBTB20基因的作用尚不清楚。本研究从动物标本检测和细胞学实验两方面探讨了 ZBTB20基因在脑肿瘤发生中的可能作用,由于脑瘤发生率及发生类型与患者年龄相关,如胶质母细胞瘤高发于老年人中,因此我们首先检测了高龄小鼠(11月龄)脑内ZBTB20基因的表达情况,初步确定了 ZBTB20基因在鼠脑内的表达定位及细胞类型。然后本研究通过慢病毒介导ZBTB20在小鼠神经母细胞瘤N2a(mouse neuroblastoma Neuro-2a cells)细胞系中高表达,检测其对N2a细胞增殖、分化和迁移能力的影响。方法1.实验动物的准备:选用C57BL/6小鼠(11月龄)。2.免疫荧光:取全脑做冰冻切片,免疫荧光显色检测小鼠脑切片中ZBTB20、微管相关蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP2),神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、GFAP 的表达,观察 ZBTB20 表达及其与 GFAP和MAP2、NSE和GFAP共定位情况。3.慢病毒包装和感染:HEK293T细胞中完成慢病毒包装,48h后收集病毒上清液,过滤后保存备用。N2a细胞分为ZBTB20-N2a组和Ctr-N2a组,分别在对数生长期感染ZBTB20过表达慢病毒和对照慢病毒,感染2d后用2μg/ml嘌呤霉素筛选7d,显微镜下观察绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)表达,流式细胞术检测EGFP阳性细胞率,免疫印迹法(western-blot,WB)检测ZBTB20蛋白表达。4.细胞增殖和分化检测:光镜下观察ZBTB20基因敲入对细胞形态的影响,利用CCK8法和平板克隆实验检测ZBTB20敲入后N2a细胞增殖能力,WB法检测ZBTB20敲入后GFAP和微管相关蛋白及tau蛋白的表达量。5.细胞迁移能力检测:利用划痕实验探讨ZBTB20敲入对N2A细胞的迁移能力的影响。结果1.免疫荧光结果显示在老龄小鼠(11月龄)海马区和皮层区均有ZBTB20基因表达,ZBTB20与MAP2、NSE和GFAP均有共定位,在神经元和星形胶质细胞的细胞核内和核外均有表达。。2.慢病毒感染N2a细胞后,经过7d嘌呤霉素筛选,EGFP阳性细胞大于90%,ZBTB20-N2a组中ZBTB20表达量显著增高。3.ZBTB20敲入使N2a细胞中GFAP蛋白和tau蛋白表达量显著增高,但细胞形态并无显著改变。3.CCK8法和平板克隆实验检测结果显示ZBTB20-N2a组和Ctr-N2a组的细胞增殖能力无显著差异。4.划痕实验表明ZBTB20-N2a组和Ctr-N2a组的细胞迁移能力无显著差异。结论1.ZBTB20在老龄小鼠皮层和海马区的神经元和星形胶质细胞中均有表达。2.ZBTB20敲入促进N2a细胞中GFAP和tau蛋白表达,但对细胞形态无影响。3.ZBTB20敲入对N2A细胞增殖和迁移能力无明显影响。