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猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)是一种肠道病原体,能引起两周龄以下仔猪发生呕吐、严重腹泻、脱水,具有高致死率。该病主要通过消化道进行传播,口服免疫能直接切断猪传染性胃肠炎病毒的传播途径,有效控制该病的发生。然而单独口服灭活全病毒并不能有效激发黏膜处的免疫应答,需要选择合适的黏膜佐剂来增强灭活全病毒的免疫原性,进而达到更好的免疫效果。近年来黏膜增强剂的开发为黏膜免疫带来了生机。枯草芽孢杆菌(B.subtilis)是一种广泛存在于土壤和植物中的优势益生菌种群,具有耐热、耐干燥、价格低、便于运输等优势。其能拮抗动物病原菌,刺激动物免疫器官生长和发育,刺激B、T淋巴细胞增殖,可以增强细胞免疫和体液免疫力。已证实B.subtilis能作为高效的黏膜佐剂,增强口服免疫效果,利用枯草芽孢杆菌作为黏膜免疫增强剂已经成为研究热点。在小鼠上利用枯草芽孢杆菌作为有效的黏膜佐剂已取得较好的结果,但在猪上的相关报道却很少。因此本研究通过体外和体内试验探索枯草芽孢杆菌配合猪传染性胃肠炎灭活病毒口服免疫对仔猪黏膜免疫力的影响,为更有效、方便地预防猪传染性胃肠炎提供理论基础。首先,将24头6周龄三元仔猪随机分为4组进行首次免疫,一周后加强免疫,方法与剂量同首免,试验期内均饲喂无抗饲料,自由饮水。首免后42天进行剖杀,通过组织切片技术检测小肠上皮内淋巴细胞(Intraepithelial lymphocyte,IEL)和CD3+ T淋巴细胞数目的变化,以此探讨枯草芽孢杆菌配合猪传染性胃肠炎灭活病毒口服免疫对消化道局部细胞免疫水平的影响。此外,通过间接ELISA检测粪便和小肠组织中猪传染性胃肠炎病毒特异性SIgA抗体水平的变化来探讨猪传染性胃肠炎灭活病毒口服免疫对消化道局部体液免疫水平的影响;通过间接ELISA检测血清中特异性IgG抗体水平的变化以探讨猪传染性胃肠炎灭活病毒口服免疫对全身体液免疫水平的影响。其次,利用仔猪肠结扎试验,通过荧光定量PCR方法检测IL-6、IL-12A和IFN-γmRNA水平的变化以及通过流式检测CD4+T、CD8+T淋巴细胞数目的变化以探讨枯草芽孢杆菌配合猪传染性胃肠炎灭活病毒口服免疫对肠黏膜中局部细胞免疫水平的影响。本研究内容主要分为以下三个部分:1枯草芽孢杆菌配合灭活TGEV 口服免疫局部细胞免疫水平的影响将仔猪小肠结扎后注射枯草芽孢杆菌和猪传染性胃肠炎灭活病毒,6 h后宰杀,收集小肠组织,应用荧光定量PCR方法检测IL-6、IL-12A和IFN-γ mRNA的表达情况。结果表明:应用枯草芽孢杆菌配合猪传染性胃肠炎灭活病毒,能显著提高小肠中IL-6、IL-12A和IFN-γ mRNA水平(P<0.01);单独应用猪传染性胃肠炎灭活病毒不能增加IL-6和IFN-γ mRNA水平,但能增加 IL-12A 的mRNA 表达量(P<0.01)。回肠末端结扎后,利用流式细胞仪检测CD4+T、CD8+T淋巴细胞数量的变化。结果表明:应用枯草芽孢杆菌配合猪传染性胃肠炎灭活病毒,相比于单独应用猪传染性胃肠炎灭活病毒能显著增加CD4+T、CD8+T淋巴细胞的数量(P<0.01)。仔猪口服免疫42天后剖杀,采集小肠组织固定后,石蜡包埋并制作组织切片,应用免疫组织化学法显示小肠CD3+T淋巴细胞的分布及数量变化,结果表明:应用枯草芽孢杆菌配合猪传染性胃肠炎灭活病毒口服免疫能显著增加小肠绒毛处CD3+ T淋巴细胞的数量(P<0.01)。应用HE染色法显示猪小肠上皮内淋巴细胞的分布及数量变化。结果表明:应用枯草芽孢杆菌配合猪传染性胃肠炎灭活病毒口服免疫能显著增加小肠黏膜上皮内淋巴细胞的数量(P<0.01)。以上四个试验结果提示,应用枯草芽孢杆菌配合猪传染性胃肠炎灭活病毒口服免疫可以有效增强仔猪消化道局部细胞免疫水平。2枯草芽孢杆菌配合灭活TGEV口服免疫对局部体液免疫水平的影响应用间接ELIS A分别检测每周粪便中猪传染性胃肠炎病毒特异性SIgA抗体水平,结果表明:首免后前三周,应用枯草芽孢杆菌配合猪传染性胃肠炎灭活病毒口服免疫后,仔猪粪便中特异性SIgA抗体水平显著提高(P<0.01);至首免第四周,特异性SIgA抗体水平逐渐下降,各组之间无显著差异。应用间接ELISA检测小肠组织中特异性SIgA抗体水平,结果表明:应用枯草芽孢杆菌配合猪传染性胃肠炎灭活病毒口服免疫后能显著增加小肠组织中特异性SIgA抗体水平(P<0.01)。以上两个试验结果提示,应用枯草芽孢杆菌配合猪传染性胃肠炎灭活病毒口服免疫可有效增强仔猪消化道局部体液免疫水平。3枯草芽孢杆菌配合灭活TGEV口服免疫全身免疫水平的影响应用间接ELISA分别检测每周血清中猪传染性胃肠炎病毒特异性IgG抗体水平,结果表明:首免后前四周,枯草芽孢杆菌配合猪传染性胃肠炎灭活病毒口服免疫能显著提高血清中特异性IgG抗体水平(P<0.01);至首免第五周,各组血清中特异性IgG抗体水平下降至正常水平,各组之间无显著差异。结果提示,应用枯草芽孢杆菌配合猪传染性胃肠炎灭活病毒口服免疫能够有效增强全身免疫应答。