黄脸油葫芦(Teleogryllus emma Ohmachi & Matsumura, T.emma)隶属蟋蟀(Grylliade),油葫芦属(Teleogryllus)。作为一类在中国分布比较广泛的昆虫,黄脸油葫芦由于个体比较大,易解剖、生活周期比较短,已成为研究昆虫胚胎发育、生理学、毒理学及基因表达调控的良好实验材料,受到学者的认可。在多细胞生物中,大多数生长发育是受到类固醇激素的调控。在昆虫生长发育过程中受蜕皮激素(ecdysone)及保幼激素(juvenile)调节。通常情况下蜕皮激素受体(ecdysone receptor, EcR)介导蜕皮激素信号通路。雌激素相关受体ERR (Estrogen-related receptor, ERR)是一种孤儿核受体,在氧化磷酸化及能量代谢过程中承担重要角色。研究发现蜕皮激素受体反应元件(Ecdysteroid receptor response element, EcREs)和雌激素相关受体反应元件(Estrogen-related receptor response element, ERREs)具有相似性,都具有‘’GGTCA"基本模式。我们推测,蜕皮激素受体基因与ERR基因之间存在相关性,可能对昆虫的生理功能有调节作用。本文选用黄脸油葫芦为实验材料,采用实时定量RT-PCR、Western-blot及免疫组织化学等方法,对黄脸油葫芦头部和胸部中蜕皮激素受体TeEcR基因在mRNA水平和蛋白质水平进行了定量与定位表达分析比较,并通过RNAi技术沉默TeEcR,探究了TeEcR与雌激素相关受体TeERR在蛋白质水平的功能相关性及其对黄脸油葫芦体生长发育过程中所起的调控作用。研究结果如下：1. TeEcR基因在黄脸油葫芦头部、胸部的表达研究(1)采用荧光实时定量RT-PCR方法对黄脸油葫芦头、胸部的TeEcR mRNA表达水平进行相对定量分析。结果表明,TeEcR基因在T.emma的头、胸部均有广泛表达,TeEcR在T.emma不同发育阶段的头、胸部转录水平较高,相比较于卵期,在若虫前期即1-3龄时期mRNA表达水平较低,若虫后期即4-6龄时期及成虫mRNA表达水平较高,4龄若虫达到最高。且通过观察4龄、5龄和6龄若虫及成虫mRNA表达水平,发现雄性的转录水平略高于雌性。这些结果与实验室前期研究TeEcR mRNA在黄脸油葫芦雌雄个体不同发育阶段整体的表达结果具有高度一致性。TeEcR基因在T.emma的头、胸部转录水平较高,我们推测TeEcR参与黄脸油葫芦神经系统发育、学习记忆、行为活动等生命活动的调控。研究发现TeEcR在胸部的转录水平略高于头部,这暗示着TeEcR在调控T.emma翅和足的发育、运动活动方面发挥更重要的作用。(2)采用Western-blot方法对TeEcR蛋白在T.emma头、胸部的表达情况进行定量分析,结果表明,TeEcR蛋白在T.emma整个发育阶段都有表达,在若虫前期1-3龄时期表达量较低,卵期、若虫后期4-6龄时期和成虫时期表达量较高,这暗示着TeEcR对黄脸油葫芦若虫后期的发育起着更重要的调控作用,而且,黄脸油葫芦4龄时期开始区分雌雄,4龄、5龄若虫期也正是卵黄蛋白合成的高峰期,我们推断此时期TeEcR的蛋白表达开始急剧上升与精、卵巢的发育密切相关。(3)采用免疫组织化学方法对TeEcR蛋白在T.emma 4龄若虫和成虫头部组织的表达情况进行定位分析。结果表明,TeEcR蛋白在雌雄脑部表达基本类似,分布较为广泛,在前脑蕈形体、视叶、中央复合体和中脑嗅叶中有很强的阳性反应,在咽侧体和围咽神经索阳性表达次之。其中,在蕈形体Kenyon细胞和视叶组织中视神经纤维的阳性反应最为强烈。TeEcR在脑部这些组织的广泛分布证明,eEcR介导的蜕皮激素调控黄脸油葫芦非常复杂的发育过程,特别是在提高T.emma神经系统的兴奋,提高学习记忆能力中发挥极其重要作用,是T.emma变态发育中一种非常重要的调节因子。2.TeEcR基因对黄脸油葫芦虫体生长发育影响(1) TeEcR-RNAi后,采用荧光实时定量RT-PCR方法对黄脸油葫芦头、胸部的TeEcR mRNA表达水平进行相对定量分析。干扰后实验组的TeEcR基因在黄脸油葫芦不同发育阶段头、胸部的mRNA水平都有显著降低(P<0.05),下调幅度达37.8%～65%,说明注射3μg的TeEcR-dsRNA,48 h后能够有效沉默黄脸油葫芦体内的TeEcR基因。(2) TeEcR-RNAi后,采用Western blot和免疫组织化学技术检测干扰后TeEcR蛋白质水平的变化,结果显示干扰后实验组的TeEcR蛋白在T.emma不同发育阶段头、胸部的翻译水平表达都有下调。免疫组化结果显示,TeEcR蛋白在脑部的前脑蕈形体、中脑嗅叶及后脑咽侧体的阳性反应明显降低,在中央复合体的黄色颗粒分布也有一定程度的减少,视叶、围咽神经索等组织无明显的变化。TeEcR蛋白在这两个组织分布减少,暗示着TeEcR在前脑蕈形体和中脑嗅叶发挥作用,蕈形体和嗅叶可能是TeEcR调控昆虫蜕皮、生长发育和调节糖吸收利用的中心。(3)对干扰的虫子进行表型观察,发现实验组的虫子蜕皮慢,甚至不蜕皮,而且发育不健全,特别表现在翅的发育和腹部膨大上,说明TeEcR在调控T.emma翅和足的发育、运动活动方面发挥更重要的作用。实验组的虫子体型与对照组相比明显变小,雌虫的产卵棒变短,虫子进食减少。这暗示着TeEcR与黄脸油葫芦生长发育过程中的能量存储有关。死亡率和畸形率统计结果显示,实验组虫子的死亡率有明显的提高,组织发育不健全,畸形率也高达75%。如此高的畸形率也正说明了TeEcR参与调控T.emma胚胎发生过程和细胞增殖与分化,是T.emma生长发育过程中非常重要的调控因子。高死亡率也表明了TeEcR介导的蜕皮激素参与了虫子的寿命调节,TeEcR被沉默后,虫子寿命减少。以上结果说明TeEcR基因被沉默后,T.emma发育不健全甚至死亡,TeEcR对T.emma的生长发育起着至关重要的作用,基因不表达可直接导致T.emma的发育畸形甚至死亡。3.TeEcR基因与TeERR基因的功能相关性研究(1) TeEcR-RNAi后,采用实时定量PCR技术和Western blot技术检测TeERR在mRNA表达水平和蛋白质表达水平的变化。结果显示,与对照组相比,实验组TeERR基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达发生变化。无论头部还是胸部,在若虫前期1-3龄阶段都表现为升高,在4龄若虫及成虫阶段都表现为下降；而在5龄、6龄若虫阶段,头胸部变化趋势不具有一致性。这表明TeEcR与TeERR存在相关性,而变化趋势的不同可能与他们所处的发育时期不同有关。根据结果推测,在1～(?)3若虫阶段可能是相互拮抗作用,而在4龄、成虫阶段可能是相互协同作用,但是具体作用方式并不明确,需要进一步的研究。(2) TeEcR-RNAi后,采用免疫组织化学技术检测TeERR蛋白在头部组织表达变化,结果显示,TeEcR-RNAi后,与对照组相比,TeERR蛋白在4龄雌性若虫头部组织分布有大量减少,其中在蕈形体没有明显变化,但是在前脑视叶、中脑和后脑组织分布明显减少。TeERR蛋白在成虫雌性头部组织分布有所减少,但是在粤.形体、中央复合体、视叶等组织并没有特别明显变化。这表明TeEcR与TeERR的相关性因黄脸油葫芦发育时期的不同而呈现不同方式,具有组织特异性。TeERR蛋白在4龄时期前脑视叶和中脑嗅叶的表达下降及成虫雌性头部组织分布的减少暗示着视叶、嗅叶是TeEcR与TeERR相互协同作用的部位,而且二者可能共同参与黄脸油葫芦视觉系统、嗅觉系统及神经系统的发育调控。