化学治疗(化疗)是癌症治疗中最为常用的治疗手段。然而传统化疗在临床应用中常出现疗效较差、毒副作用过大等问题。如何实现药物的有效递送和可控释放,从而提高化疗治疗效果、降低毒副作用是癌症治疗中亟待解决的问题。化疗与基因治疗联合治疗,是提高肿瘤化疗效果、减轻毒副作用的一种常用治疗手段。将化疗药物与基因装载于同一载体中,有利于实现两者生物药剂学性质同步化,确保化疗药物与基因以合适比例递送至同一靶细胞。化疗与基因治疗联合治疗的研究一直是癌症联合治疗研究领域的热点和难点。近年来,纳米载药系统在癌症治疗领域具有广泛应用。与传统小分子化疗药物相比,纳米载药系统可通过高通透性和滞留(enhanced permeability and retention effect,EPR)效应被动靶向于肿瘤组织,可改善药物体内无选择性分布,提高肿瘤组织局部药物浓度,有利于提高抗肿瘤效果、减轻毒副作用。同时,纳米载药系统可将化疗药物与基因装载于同一载体,在联合治疗研究领域占有重要地位。纳米载药系统通过EPR效应富集于肿瘤组织后,还需进一步实现药物可控释放,方可发挥最佳药效。基于由生理环境(pH 7.4)到肿瘤微环境(约pH 6.5)再到肿瘤细胞内吞体/溶酶体(约pH 5.0)pH的逐级降低,构建具有壳核结构的逐级pH敏感纳米载药系统,在药物可控递送领域具有巨大应用潜力。壳核结构逐级pH敏感纳米载药系统的设计理念为:在正常生理组织及血液循环中,负电性外壳的包裹可使纳米载药系统维持稳定,有利于延长循环时间,避免药物提前泄露导致对正常生理组织产生毒性;到达肿瘤组织后,肿瘤微酸性环境中,负电性外壳脱落,暴露出的正电性内核易被肿瘤细胞摄取入胞;入胞后的纳米载药系统在内吞体/溶酶体酸性环境中,进一步pH敏感释放药物,发挥抗肿瘤效果。第一重/肿瘤微环境pH敏感联合第二重/细胞内pH敏感的逐级pH敏感策略,能够实现药物的肿瘤细胞内精准释放,提高抗肿瘤效果、减轻毒副作用。纳米载药系统的高载药量是发挥治疗效果的基础。双方法载药是提高纳米载药系统中药物装载量的常用方法。物理装载联合化学连接的双方法载药策略可弥补单一方法载药的不足,提高抗肿瘤效果。基于上述设计理念,本课题采用双方法载药策略联合逐级pH敏感策略构建了逐级pH敏感双方法载盐酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride,DOX)纳米粒。即,首先合成pH敏感腙键连接的聚乙烯亚胺-多柔比星结合物(PEI-C-DOX),随后选择21个碱基对的寡聚核苷酸(CGA-ODNs)作为物理装载DOX的载体,经室温孵育获得载DOX的CGA-ODNs(OD),PEI-C-DOX压缩OD得到化学连接联合物理装载的双方法载DOX复合物PEI-C-DOX/OD(POD)。以pH敏感两亲性聚电解质羧甲基壳聚糖(O-carboxymethyl-chitosan,CMCS)作为外壳材料包裹POD,得到逐级pH敏感双方法载DOX纳米粒CMCS/POD(CPOD)。在上述研究基础上,本课题进一步采用一步共装载策略构建了 DOX与pDNA共递送纳米粒。即,选择增强型绿色荧光蛋白质粒DNA(enhanced green fluoresycent protein,pEGFP)作为模型基因,PEI-C-DOX 压缩 OD 与 pEGFP 混合物可实现药物与基因一步共装载,得到共递送复合物PEI-C-DOX/OD&pEGFP(PODE),PODE外层包裹CMCS得到共递送纳米粒CMCS/PODE(CPODE)。CPODE同样具有逐级pH敏感性,并为今后的化疗与基因治疗联合治疗奠定了基础。主要研究方法和结果如下:1.DOX含量测定方法建立本章运用紫外分光光度法建立DOX体外含量测定方法,结果表明DOX在5-35μg/mL浓度范围内线性良好(r=0.9994),低、中、高浓度日内、日间精密度及方法回收率符合测定要求。运用荧光分光光度法建立DOX不同pH条件下体外含量测定方法,结果表明,pH 7.4条件下DOX在51-1020 ng/mL浓度范围内线性良好(r=0.9995),低、中、高浓度日内、日间精密度及方法回收率符合测定要求,pH 5.0条件下DOX在50-1000 ng/mL浓度范围内线性良好(r=0.9993),低、中、高浓度日内、日间精密度及方法回收率符合测定要求。2.逐级pH敏感载DOX纳米粒的构建及其理化性质初步评价本章首先合成PEI-C-DOX,1H-NMR及IR验证其结构。室温孵育制备OD,荧光光谱扫描确定其最优装载比例为0.12:1。对OD进行初步稳定性考察,结果表明,4℃条件下,24h内DOX无明显释放,OD稳定性较好。采用静电自组装的方式分别构建POD及CPOD,通过琼脂糖凝胶电泳分析及理化性质初步评价对POD和CPOD分别进行处方筛选,确定最优处方。POD最优处方为PEI与CGA-ODNs质量比339:64,CPOD最优处方为CMCS与CGA-ODNs质量比75:4。最优处方POD及CPOD均微观形态圆整,粒径分布较为均匀。POD平均粒径(140.2±5.2)nm,PDI 0.144±0.018,zeta电位(20.4±1.9)mV。CPOD平均粒径(165.0±3.3)nm,PDI 0.191±0.001,zeta电位-(15.6±0.82)mV。血浆稳定性实验表明,在10%血浆中,POD稳定性较差,CPOD可在24 h内保持粒径稳定。溶血实验表明CPOD在实验浓度范围内未出现溶血现象,溶血百分率均小于5%,安全性较好。3.CPOD逐级pH敏感性评价及体内外抗肿瘤效果初步评价。CMCS体外pH敏感脱落实验结果表明,肿瘤微酸性pH条件下,CMCS可发生电荷翻转并从CPOD表面脱落。在B16及HepG2两种细胞系中,流式细胞分析结果表明,pH 6.5及pH 6.0条件下CPOD的摄取率均明显高于pH 7.4(B16p<0.005,HepG2p<0.01),验证了CPOD第一重/肿瘤微环境pH敏感性。体外释放实验表明,48 h,pH 5.0条件下CPOD累积释放量明显多于pH 7.4条件下(p<0.005)。pH敏感入核实验结果表明,在B16及HepG2两种细胞系中,pH 6.5及pH 6.0条件下CPOD可入胞,并释放DOX,4 h时释放的DOX已基本完全入核,验证了CPOD第二重/胞内pH敏感性。MTT实验结果表明,B16细胞系中,游离DOX细胞毒性强于CPOD;HepG2细胞系中,CPOD细胞毒性与DOX相当。实验浓度范围内,空白纳米载体在两种细胞系中均未表现出明显细胞毒性,安全性较好。实时近红外小动物活体成像结果表明,CPOD自小鼠静脉注射给药1 h时开始富集于肿瘤部位,并持续至24 h。24 h,CPOD组离体肿瘤荧光强度是游离药物组的3.46倍,验证了CPOD肿瘤靶向性。荷瘤小鼠模型体内抗肿瘤实验结果表明,CPOD抑瘤效果优于两倍剂量游离药物组(瘤体积p<0.005,瘤重p<0.05),且未导致小鼠体重减轻。组织切片实验结果表明,CPOD未导致小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)病变,体内安全性较好。4.DOX与pEGFP共递送纳米粒的构建及初步评价构建DOX与pEGFP共递送纳米复合物PODE,CMCS包裹PODE构建CPODE,分别对其进行处方考察。PODE最优处方为PEI与pEGFP质量比68:24,转染效率为11.8±0.10%。CPODE最优处方为CMCS与CGA-ODNs质量比75:8。最优处方PODE及CPODE均微观形态圆整,粒径分布较为均匀,PODE平均粒径为(77.61±5.7)nm,PDI为0.265±0.019,zeta电位为(4.63±0.33)mV。CPODE平均粒径为(169.3±3.5)nm,PDI为0.191±0.097,zeta电位为-(12.8±0.61)mV。抗核酸酶能力实验表明,CPODE抗核酸酶能力优于PODE。血浆稳定性实验表明,CPODE血浆稳定性较好,可保护pEGFP不被完全降解。CMCS的包裹可提高CPODE抗核酸酶能力和血浆稳定性。CPODE程序性释放实验表明,DOX先行释放,12 h累积释放量为51.5%,pEGFP释放需要超过12 h或更长时间。CPODE共递送行为考察结果表明,CPODE具有良好的共递送DOX与pEGFP的潜能,HepG2细胞系pH 6.0条件下共递送效率为29.5%。综上所述,本课题构建的新型纳米载药系统CPOD可提高DOX治疗效果,且具有较好的安全性,具有潜在应用价值。CPODE可实现DOX与pDNA共递送,为化疗和基因联合治疗载体的构建提供了一种新思路。