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多环芳烃(PAHs)是一类由两个或两个以上的苯环以线性、角状或簇状排列的稠环化合物,主要来源于人类活动或能源利用过程,是重要的食品与环境污染物。生物降解是一种去除环境中多环芳烃的有效方法。细菌趋化性是菌体对环境的响应,主要包括对有利环境的趋附和对有害环境的避离。细菌趋化有利于细菌对底物的利用。研究表明,细菌的趋化性能够增强细菌在自然界中降解污染物的效果,已知一些种属的细菌对芳香族化合物有趋化能力。Novosphingobium pentaromativoransUS6-1能以多种多环芳烃作为唯一碳源和能源生长,是一株良好的芳烃污染环境的生物修复菌。而该属细菌对芳香族化合物的趋化性研究却鲜有报道。本论文主要以US6-1为研究对象,采用基因组学、转录组学、同源重组基因敲除等技术对其趋化基因、趋化蛋白及对不同底物的趋化现象等进行了研究,获得的主要结果如下:1.首先我们在基因组和转录组水平上对其趋化相关基因和蛋白进行了分析,发现有29个基因注释到KEGG的细菌趋化性通路上。其中绝大多数位于染色体上,少数位于质粒上,包括:6个甲基趋化受体蛋白MCP,1个组氨酸激酶CheA,1个偶联蛋白CheW,14个反应调节子CheY,2个MCP甲基化酶CheB,2个MCP甲基转移酶CheR,1个趋化受体谷氨酰胺脱酰胺酶CheD,1个鞭毛定子MotA和1个MotB。分析转录组数据发现,BaP诱导下MCP表达均有不同程度上调,其中 MCP2035(JI59_RS02035)和 MCP3030(JI59 RS03030)差异性表达显著。通过以上分析,我们获得了参与US6-1完整趋化通路的一系列基因和蛋白。2.为了确定在US6-1对PAHs趋化过程中起作用的MCP,我们分别运用SMART和Phyre2数据库对US6-1甲基受体趋化蛋白的高级结构进行预测,得到了 MCP3030(JI59_RS03030)和 MCP18870(JI59_RS18870)配体结合域(LBD)的三维结构,两者都为4个α螺旋束。MCP配体结合域的预测有助于趋化底物的确定。3.我们分别采用滴定法和游动平板法研究了 US6-1对简单化合物(TCA循环中间物及单环化合物)和多环芳烃(菲、芘、苯并芘等)的趋化性。US6-1对简单化合物的趋化现象3h内就能检测到,而其对多环芳烃的趋化4d后才能观察到。造成这种差异的原因可能是多环芳烃的难降解性,说明US6-1对多环芳烃的趋化可能是降解依赖的。4.定点敲除US6-1组氨酸激酶基因cheA,以此来探究US6-1对苯并芘趋化与降解之间的关系。结果表明,与野生型相比,cheA基因被敲除后,US6-1△cheA对苯并芘的降解能力明显下降,cheA基因的缺失极大地影响了菌体对苯并芘的降解。5.分别通过基因敲除和MCP配体结合域的体外表达研究MCP18870在菌体US6-1趋化过程中行使的功能。首先,通过同源重组获得了 MCP18870基因缺失株,趋化实验表明,US6-1△mcp18870失去了对邻苯二酚的趋化,其次利用蛋白的异源表达技术,在体外获得了 MCP18870的配体结合域,并通过荧光光谱实验证明该蛋白能与龙胆酸发生特异性结合。综上所述,MCP18870能触发菌体US6-1对邻苯二酚和龙胆酸的趋化。