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目 的:1.探讨解决软骨细胞大量增殖过程中的去分化及增殖率下降问题。 2.研究了解胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-I)对三维培养条件下关节软骨细胞生长和去分化趋势等生物学行为的影响,以期获得大规模生物学性状良好的软骨细胞。3.建立较为成熟和稳定的关节软骨细胞的体外三维培养体系,为临床开展自体软骨细胞移植,治疗关节软骨损伤及组织工程提供一个基础性研究。方 法:1.软骨细胞的来源 取四周龄新西兰兔,超净台内无菌条件下片状切取双肩、双膝、双髋关节软骨,用机械和酶消化法获得单个软骨细胞,制成细胞悬液。 2.软骨细胞的体外单层及三维培养 首先对取得的兔关节软骨细胞行单层培养,取第二代单层培养细胞转入藻酸钠三维培养体系。3. IGF-I对软骨细胞增殖情况影响的检测 A)采用MTT法测定不同浓度IGF-I对三维培养软骨细胞增殖情况的影响。B)绘制细胞生长曲线,以研究各对照组在短期内的细胞增殖情况的差异。4.软骨细胞的鉴定 采用HE染色及显微镜下观察细胞形态,对软骨细胞特异性分泌产物II型胶原的免疫组化观察,鉴定软骨细胞来源。<WP=6>结 果:1、利用机械与酶消化法获得的软骨细胞,成功的进行了体外单层及三维培养,构建了稳定的软骨细胞体外三维培养体系。2、三维培养条件下软骨细胞增殖成团族状,IGF-I作用下的软骨细胞计数水平及细胞集落明显高于无IGF-I作用组。3、不同浓度的IGF-I作用下的软骨细胞OD值测定均较对照组明显增高,以50ng/ml浓度时OD值最高,促增值效应最明显。4、IGF-I作用下培养8周后从凝胶体系中收获细胞的软骨细胞特异性II型胶原表达水平较转入三维体系前未见明显降低,HE染色显示细胞形态为圆形,培养细胞保持了良好的分化表型。结 论:1、不同浓度IGF-I均可明显刺激三维培养条件下关节软骨细胞增殖及集落形成,以50ng/mlIGF-I促增值作用最明显。2、IGF-I与三维培养共同作用8周条件下,关节软骨细胞保持了良好的表型,保持了正常的软骨细胞形态和分泌功能。3、成功的构建了藻酸钠凝胶三维培养体系,并与IGF-I联合使用获得了一定规模数量的表型稳定的软骨细胞,为获得大规模种子细胞来源提供了一种可能。4、单层培养软骨细胞在短期内的增殖速率要高于IGF-I作用下的三维培养软骨细胞,但由于其不能保持良好的软骨细胞分化表型,不能作为一种长期的软骨细胞培养体系,可考虑先行单层培养,扩增几代后,再转入IGF-I作用下的三维培养体系,以期在较度短时间内获得较大数量规模的软骨细胞。