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单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌）和绵羊李斯特菌（Listeria ivanvii）是李斯特菌属中两种常见食源性致病菌,尤其是单增李斯特菌,其感染后会引发脑膜炎、败血症等疾病,易感人群致死率高达30%。基于靶序列扩增的核酸检测方法因具有快速、灵敏等优点而被广泛应用于李斯特菌鉴定。然而目前用于李斯特菌检测的靶标数量有限、且在遗传进化过程中可能受到环境胁迫等因素发生突变或缺失。因此,挖掘李斯特菌相关的特异性分子检测新靶标,在此基础上建立灵敏、特异的核酸检测方法具有十分重要的意义。本研究利用二代测序与生物信息学技术构建了李斯特菌全基因组数据库及靶标挖掘平台,获得了李斯特菌属常见菌种和单增李斯特菌血清型相关的特异性分子检测新靶标,并基于新靶标建立了多重PCR（multiplex PCR,m PCR）、基于PCR或重组酶介导核酸扩增（recombinase aided amplification,RAA）的CRISPR/Cas12a荧光检测（PCR/RAA-Cas12a FDet）、RAA-CRISPR/Cas12a电化学检测（RAA-E-CRISPR）以及基于RAA-CRISPR/Cas13a的离心式微流控芯片。本论文的主要研究内容和研究结果如下:1、收集本团队2011年到2016年单增李斯特菌污染调查研究中4300份食品样本和925株分离株信息,结合本团队测序的841条单增李斯特菌全基因组序列,构建“食源性单增李斯特菌全基因组数据库”。联合NCBI中李斯特菌全基因组序列,结合泛基因组分析技术,搭建李斯特菌属常见菌种与血清型相关的分子检测靶标挖掘平台。结果表明,单增李斯特菌分离株属于五种血清型:1/2a、1/2b、1/2c、4b和4c,其具有开放的泛基因组,包含528个核心基因,可划分为三个谱系型:I、II、III。利用靶标挖掘平台,获得李斯特菌属常见菌种和单增李斯特菌血清型相关的候选靶标分别为50、37个。2、采用PCR对候选靶标的特异性和灵敏度进一步评价,获得16个李斯特菌属常见菌种的特异性分子检测新靶标,其中李斯特菌属、单增李斯特菌和威尔氏李斯特菌靶标各1个,英诺克李斯特菌与绵羊李斯特菌靶标各3个,格氏李斯特菌与西氏李斯特菌靶标分别为2、5个。同时也获得14个单增李斯特菌血清型相关的特异性新靶标,包括谱系型I（1/2a-3a-1/2c-3c）、II（1/2b-3b-4b-4d-4e-4ab-7）、III（4a-4c）靶标分别为1、2、3个,血清组I.1（1/2a-3a）、I.2（1/2c-3c）、II.1（4b-4d-4e-4ab）、II.2（1/2b-3b-7）靶标分别为2、1、1、1个、4a和4c血清型靶标分别为1、2个。部分靶标PCR检测灵敏度达到10~2CFU/m L。对特异性靶标进行生物学功能预测分析,其编码蛋白与感染宿主、碳水化合物转运以及适应不同生长环境有关,但大部分靶基因编码蛋白属于假定蛋白。3、基于李斯特菌种属新靶标,建立致病性李斯特菌m PCR方法用于检测单增李斯特菌和绵羊李斯特菌,在纯培养液中其检测限分别为2.0×10~3CFU/m L和3.4×10~3CFU/m L。同时,采用血清型相关的新靶标建立了两种“谱系型”m PCRs方法,用于快速鉴定单增李斯特菌血清组I.1、I.2、II.1、II.2、III。在基因组DNA中其检测限分别为0.771 pg/μL和1.76 pg/μL。以上m PCR方法对目标菌均表现出良好的特异性。将所建立的m PCR应用于129份金针菇厂样本检测,李斯特菌和单增李斯特菌的检出率分别为58.1%和41.1%,对其中24份样本进行血清型检测,鉴定出四个血清组I.1、I.2、II.1、II.2,m PCR结果与传统培养法具有良好一致性。4、利用CRISPR/Cas12a的“附属切割”活性,建立了PCR/RAA-Cas12a FDet方法检测4c血清型单增李斯特菌。该方法将PCR或RAA反应试剂与CRISPR/Cas12a裂解试剂封装于反应管中,扩增后通过离心进行Cas12a FDet检测,有效避免气溶胶污染。结果表明:PCR/RAA-Cas12a FDet对目标血清型表现出良好的特异性,在纯培养液中其检测限分别为34 CFU/m L和1.4×10~2CFU/m L。在基因组DNA和加标样品中,RAA-Cas12a FDet方法的检测限分别为0.64 amol/L和1.4×10~3CFU/g草鱼。5、将CRISPR/Cas12a的“附属切割”活性创新性引入电化学平台,建立了RAA-E-CRISPR方法用于单增李斯特菌检测。该方法将亚甲基蓝（Methylene blue,MB）修饰的ss DNA探针（MB-ss DNA）固定于金电极表面。在目标菌存在情况下,RAA产物激活Cas12a的“附属切割”能力,MB-ss DNA从电极表面脱落,通过测定反应前后的电流信号即可实现对目标菌检测。结果表明:RAA-E-CRISPR方法具有良好的特异性,在基因组DNA、纯培养液以及加标样品中其检测限分别为0.68 amol/L、26 CFU/m L和9.4×10~2CFU/g金针菇,相比于RAA-Cas12a FDet,其灵敏度提高了10倍。6、为实现一步、多重检测,建立了基于RAA-CRISPR/Cas13a的离心式微流控芯片用于同时检测单增李斯特菌和英诺克李斯特菌。在微流控芯片制作过程中,将RAA-CRISPR/Cas13a试剂预包埋于反应池中。操作人员只需将核酸样品加入样本池中,其扩增、检测以及数据读取可在微流控设备上自动完成。结果表明:该方法对目标菌表现出良好的特异性,对单增李斯特菌和英诺克李斯特菌基因组DNA的检测限为0.40amol/L和0.74 amol/L,无增菌条件下纯菌培养物的检测限为40 CFU/m L和26 CFU/m L,在加标金针菇样本其检测限为3.4×10~3CFU/g和2.6×10~2CFU/g。综上所述,本论文构建了李斯特菌全基因组数据库及分子检测靶标挖掘平台,获得了一批具有我国自主知识产权的李斯特菌相关的特异性分子检测新靶标,有效弥补现有靶标的不足。此外,将CRISPR/Cas“附属切割”活性创新性引入电化学平台、离心式微流控芯片中,采用新靶标建立了一系列基于CRISPR/Cas的快速、灵敏且特异的核酸检测方法,提高了现有CRISPR/Cas核酸检测系统的检测性能,拓宽了其应用,为单增李斯特菌风险识别、溯源追踪以及快速检测提供基础数据和技术支撑。