肝细胞肝癌(HCC)是我国恶性肿瘤相关死亡的主要原因之一,虽然有手术、血管栓赛、放疗以及其他辅助治疗方法,但其远期疗效依旧不容乐观,由于起病隐匿,早期无明显症状,大部分患者首次诊断时已是局部晚期或转移性疾病,失去了手术治疗的机会。肝癌的靶向治疗的相关研究尚处于起始阶段,目前尚无针对肝癌特效的靶向药物。RNA作为连接DNA和蛋白质的关键枢纽,在生命系统中的作用受到越来越多科研人员的关注,而DDX蛋白家族RNA解旋酶参与了RNA代谢的全过程。针对DDX10在实体肿瘤中的表达及生物学功能少有报道,仅报道DDX10在卵巢癌中低表达并促进细胞增殖。鉴于DDX解旋酶在细胞生命活动中的重要地位,对该家族成员的功能及其与人类肿瘤关系的进一步研究,探索其上下游效应分子,明确其作用机制和调控机理,将为肿瘤的早期诊断和生物靶向治疗提供新的途径。本课题拟研究DDX10在肝癌中的表达情况、生物学功能以及可能的机制。第一部分DDX10在肝癌中的表达目的:旨在研究DDX蛋白家族RNA解旋酶成员DDX10在肝癌组织及细胞系中的表达情况。以及DDX10表达情况与临床预后的关系。方法:从公共数据库GEO中下载肝癌基因表达谱芯片数据(GSE36376和GSE14520),芯片数据包含肝细胞癌组织及癌旁正常肝组织数据。数据下载后采用RMA算法对芯片数据进行预处理。利用R语音平台的基因芯片显著性分析(SAM)算法筛选差异性基因。后对DDX10基因行显著性分析。对收取的53对肝癌及癌旁正常组织标本行免疫组织染色,检测DDX10蛋白在肝癌组织及癌旁组织的表达行统计学分析。用qPCR法分析DDX10 mRNA在正常肝细胞系(LO2)及肝癌细胞系(HepG2、Hep3B、Huh7)的表达情况,western blot验证DDX10蛋白在细胞系中的表达。利用在线TCGA数据库分析工具GEPIA分析DDX10的表达与临床预后的关系。结果:1.GEO数据分析显示DDX10在肝癌组织中高表达。2.免疫组化示大部分肝癌组织样本(79.25%)中DDX10表达较癌旁组织相比显著增高。3.DDX10在正常肝细胞系中低表达,在肝癌细胞系HepG2中低表达,在Hep3B、Huh7两株肝癌细胞系中高表达。4.TCGA数据库分析DDX10与临床预后的关系示,DDX10高表达组获得更短的无病生存期及总生存期。结论:DDX10基因在肝癌组织和肝癌细胞株中高表达并提示预后不良。第二部分DDX10在肝癌中的生物学功能研究目的:探索DDX10在肝癌中的生物学功能。方法:应用shRNA技术沉默肝癌细胞株Hep3B、Huh7两株肝癌细胞系中DDX10基因的表达,通过体外细胞功能实验:CCK-8检测、细胞克隆形成检测,阐明DDX10基因对肝癌细胞增殖和克隆形成能力的影响。结果:1.用DDX10-shRNA-LV靶向沉默细胞系Hep3B和Huh7中的DDX10基因,western blot显示DDX10表达量明显减低。2.CCK-8检测结果提示,DDX10基因沉默组与对照组细胞相比的增殖能力明显减弱。3.细胞克隆形成能力检测显示,相对于对照组,DDX10基因沉默组细胞克隆形成数量显著减少(P<0.05)。结论:shRNA慢病毒介导的RNAi可有效抑制DDX10基因的表达。沉默DDX10基因可抑制肝癌细胞生长与增殖,并显著抑制肝癌细胞克隆形成。第三部分沉默DDX10基因抑制肝癌细胞增殖的机制研究目的:前两部分我们的数据证实DDX10在肝癌中高表达,沉默DDX10后肝癌细胞增殖减低及克隆形成减少。本部分我们进一步探讨沉默DDX10基因抑制肝癌细胞增殖的机制。方法:Western blot验证DDX10沉默前后β-catenin的表达情况及分布情况。分别构建FOP、TOP质粒,行双萤光素酶报告基因检测。应用wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWR-endo来检测DDX10对细胞增殖的影响。结果:1.在Hep3B和Huh7肝癌细胞系中,DDX10沉默组较对照组核内β-catenin表达量明显减低。2.双萤光素酶报告基因检测结果提示沉默DDX10后β-catenin活性减低。3.高表达DDX10后细胞增殖活跃。加入wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWR-endo组与对照组相比,细胞增殖明显减慢,其差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:DDX10通过调控wnt/β-catenin信号通路进而调节细胞增殖。