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近年来,随着分子生物学技术的提高,以及在细胞受体和增殖调控的分子水平对肿瘤发病机制的进一步认识,人们开始进行以细胞受体、关键基因和调控分子为靶点的治疗,亦称之为靶向治疗。靶向治疗更有效,且对正常细胞毒性更小。本课题的研究目的是利用能够被基质金属蛋白酶激活的改构炭疽毒素实现肿瘤的靶向杀伤。方法是将基质金属蛋白酶的作用位点替代Furin的作用位点形成改构PA,在过表达MMPs与uPA的肿瘤细胞表面,改构PA被选择性激活,使重组毒素进入细胞内,对过表达MMPs与uPA的肿瘤细胞产生选择性杀伤,而对正常细胞没有毒性。除了对Furin进行单一替换之外,我们还进行了MMPs与uPA的串联构建,从而对肿瘤靶向杀伤的广谱性进行可行性探讨。我们构建了pET-32a-PA重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了融合表达,并验证了重组PA蛋白的特异性。采用Ni2+金属螯合柱纯化重组PA蛋白,并经过透析复性,纯度约为76%。通过Furin蛋白酶体外降解实验与细胞结合实验,证明复性后的重组PA可以被正确的识别和降解,并且能与LF共同作用产生细胞毒性,从而为改构蛋白的表达打下了基础。我们摸索了融合表达、纯化PA蛋白的方法,表达了6种改构蛋白,分别是MMP2作用位点替代Furin酶作用位点形成改构蛋白PA(MMP2),相应的其它改构蛋白为PA(MMP9)、PA(uPA)、PA(MMP2+MMP9)、PA(MMP2+uPA)、PA(MMP2+MMP9+uPA)。体外实验表明改构PA能被MMPs降解,串联位点改构PA能分别被设计方案中的任何一种酶降解。对人纤维肉瘤细胞HT1080和人乳腺癌细胞MDA-MB-231两种肿瘤细胞进行了细胞毒性实验,实验结果显示改构PA能与LF共同作用于肿瘤细胞产生细胞毒性。免疫荧光实验表明改构PA与LF共同作用于人纤维肉瘤细胞HT1080后,细胞的形态发生了明显变化。本文对应用炭疽毒素实现广谱性的肿瘤靶向杀伤进行了可行性研究,初步探索了建立靶向多种肿瘤细胞的药物导向系统的方法,为临床应用奠定了基础。