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棉花是世界范围内的重要经济作物和战略资源,在我国国民经济中占据重要地位,但棉花在生产过程中不可避免地受到多种病害的影响,其中枯萎病是危害最严重的病害之一,严重影响了我国棉花的产量和质量。抗性品种的选育是从根本上防治棉花枯萎病的有效措施,随着作物分子生物学和育种技术的不断发展,精准高效的分子育种成为作物育种的主要手段之一。因此,研究棉花对枯萎病抗性调控的分子机制对棉花抗病品种选育以及棉花产业的稳定发展具有重要意义。多项研究表明丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）级联通路在植物免疫反应中发挥着重要的作用,棉花中有多个MAPKs被证明参与了对枯萎病抗性的调控过程,但针对棉花MAPKs如何影响下游底物蛋白进而发挥枯萎病抗性调控功能的研究相对较少。本实验室的前期工作发现GhMKK6-GhMPK4级联信号通路在棉花对枯萎病的抗性调控过程中发挥着重要作用,并通过定量磷酸化蛋白质组学技术鉴定到了一个可能在GhMKK6-GhMPK4级联信号通路下游发挥抗性调控功能的转录因子CotAD＿59974,在本研究中根据序列分析结果将其命名为GhbHLH122。本研究以陆地棉（Gossypium hirsutum）为研究材料,通过生物化学、分子生物学等一系列研究方法,较为系统地解析了GhbHLH122参与调控棉花植株对枯萎病原菌抗性的分子机制,本研究扩展了参与棉花对枯萎病抗性调控的GhMKK6-GhMPK4级联信号通路,为棉花的抗病育种奠定了基础。主要研究结果如下:（1）通过保守结构域分析发现CotAD＿59974属于bHLH转录因子家族,因此将其命名为GhbHLH122,随后与拟南芥bHLH转录因子的进化关系分析表明GhbHLH122属于IX亚族的bHLH转录因子,与拟南芥FLOWERING bHLH（FBH）1-4属于同一亚族。与多个FBHs蛋白的序列分析发现GhbHLH122具有典型的basic-helix-loop-helix（bHLH）结构域,转录激活分析表明GhbHLH122具有转录激活活性,荧光素酶互补实验结果证明GhbHLH122可以形成同源复合体。FBHs是一类主要在维管束中表达的转录因子,本研究通过GUS染色分析发现GhbHLH122主要在转基因拟南芥的维管束内表达,这进一步表明GhbHLH122是典型的FBH转录因子。（2）本研究通过酵母双杂交、荧光素酶互补和GST pull down实验证明了GhbHLH122与GhMPK4之间存在相互作用。通过点突变技术构建了组成型激活的GhMPK4（CA-GhMPK4）,并通过荧光素酶互补实验证明了CA-GhMPK4仍保持与GhbHLH122的相互作用。Phos-tag SDS-PAGE结果表明GhbHLH122可以被CA-GhMPK4磷酸化。此外,实验室前期工作发现在GhMKK6组成型激活的棉花中GhbHLH122的磷酸化水平升高,结合本研究的实验结果初步证明GhbHLH122在GhMKK6-GhMPK4级联信号通路的下游发挥作用。（3）通过病毒介导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）技术在棉花中沉默GhbHLH122后进行了抗病功能分析,结果表明沉默GhbHLH122后增强了棉花对枯萎病原菌的抗性,其植株中的枯萎病原菌相对生物量也明显低于对照植株,水杨酸（SA）信号通路的关键基因Gh ICS1、Gh NPR1和Gh PAD4表达水平明显升高。通过花序浸染法获得了GhbHLH122过表达拟南芥,抗病功能分析发现GhbHLH122过表达拟南芥株系在接种枯萎病原菌后发病程度明显重于野生型,植株中的枯萎病原菌的相对生物量明显高于野生型,SA信号通路中的关键基因At EDS1,At ICS1,At NPR1和At PAD4表达水平明显下调。这些结果表明GhbHLH122负调控植株对枯萎病原菌的抗性。（4）通过转录组测序分析了GhbHLH122沉默和对照棉花植株接种枯萎病原菌后的差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）,GO和KEGG富集分析结果表明棉花中乙烯的生物合成过程受到了抑制,多个乙烯生物合成和信号转导基因表达水平明显下降。GhbHLH122沉默后棉花植株的乙烯释放速率显著降低,GhbHLH122过表达拟南芥株系中乙烯合成前体ACC含量明显高于野生型,并且部分乙烯生物合成和信号转导基因明显上调,这表明GhbHLH122促进了植株中的乙烯生物合成过程。此外,表型分析发现GhbHLH122过表达拟南芥株系在光照条件下表现出根长较短、下胚轴伸长的表型,乙烯合成的前体ACC处理后加重了这种表型,这是典型的光照条件下乙烯诱导的表型,而添加了乙烯受体抑制剂Ag NO3后消除了下胚轴伸长的表型;GhbHLH122过表达拟南芥株系在黑暗条件下表现出典型的乙烯诱导的三重反应表型,即根系生长和下胚轴伸长受到抑制、下胚轴膨胀和顶端弯钩收紧,这种表型同样在ACC处理后加重,而在添加乙烯受体抑制剂Ag NO3后,完全消除了三重反应表型,这进一步表明GhbHLH122促进了拟南芥的乙烯生物合成过程。另外,乙烯利处理之后促进了枯萎病原菌在棉花中的侵染过程。结合GhbHLH122抗病功能分析的结果可以证明GhbHLH122通过促进乙烯的生物合成来负调控植株对枯萎病原菌的抗性。（5）通过转录组数据分析,发现两个ACC synthetase（ACS）基因CotAD＿56685和CotAD＿61184在GhbHLH122沉默并接种病原菌后表达水平明显下调,进化分析表明这两个ACS与拟南芥ACS6进化关系最近,属于I类ACS,因此命名为GhACS6a和GhACS6b。对这两个基因的启动子序列分析发现在其ATG上游1500 bp的序列内分别有4个和5个bHLH转录因子结合位点（E-box）。利用酵母单杂交、EMSA和双荧光素酶报告基因实验,证明了GhbHLH122可以特异性地结合GhACS6a和GhACS6b启动子并促进这两个基因的转录。利用双荧光素酶报告基因实验,证明了GhMPK4可以提高GhbHLH122促进GhACS6a和GhACS6b转录的能力。此外,在棉花中瞬时表达GhbHLH122或GhMPK4之后,GhACS6a和GhACS6b的表达水平显著升高,而在沉默GhbHLH122或GhMPK4之后这两个ACS的表达水平明显降低。这些结果表明GhbHLH122通过促进GhACS6a和GhACS6b的转录来调节乙烯的生物合成,进而负调控棉花植株对枯萎病原菌的抗性,而GhMPK4可以促进这个过程。（6）利用VIGS技术在棉花中分别沉默了GhACS6a和GhACS6b,抗病功能分析结果表明GhACS6a或GhACS6b沉默之后均提高了棉花植株对枯萎病原菌的抗性,并且植株中的枯萎病原菌相对生物量明显低于对照组,这与GhbHLH122沉默棉花的抗病表型相一致,进一步证明GhbHLH122通过调控GhACS6a和GhACS6b的转录促进乙烯的生物合成,进而调控棉花植株对枯萎病原菌的抗性。综上所述,转录因子GhbHLH122在GhMKK6-GhMPK4信号通路的下游发挥枯萎病抗性调控功能,GhMPK4参与介导了GhbHLH122调控GhACS6a和GhACS6b的转录激活过程,进而促进乙烯的生物合成,最终实现棉花植株对枯萎病原菌抗性的负向调控。