鸭胚中新型抗氧化肽的筛选及对细胞氧化损伤的保护机制

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鸭胚蛋营养丰富,而且具有一定的功能特效,对人体营养和健康起着重要作用。由鸭胚蛋为原料制成的保健食品有广阔的发展前景。研究发现,鸭胚蛋具有一定的抗氧化能力,但是具体发挥该功能的物质尚未明确。同时,鸭胚蛋中含有大量的多肽,尚未有相对应的研究。基于此,本论文运用测定鸭胚蛋孵育期间抗氧化能力强弱和抗氧化物质含量实验、细胞毒性实验、鸭胚多肽对H2O2诱导的Hep G2细胞保护作用实验以及通过生物信息学预测和热点肽基识别等一系列技术手段,研究了鸭胚蛋孵化过程中内源性抗氧化物质的动态变化。且将孵育至15天的鸭胚蛋(表现出的抗氧化活性最强)进行脱脂除杂,探索鸭胚多肽的抗氧化活性与其分子量范围之间的关系。对抗氧化活性最强的肽段(≤3 k Da)进行离子交换柱层析分离得到单个肽段,再经LC-MS/MS鉴定多肽序列后进行功能注释、生物信息学预测和热点识别筛选潜在的功能多肽。最后对筛选得到的抗氧化多肽进行活性验证及抗氧化机制探索。本课题的主要研究内容和相应结果如下:(1)通过测定各种内源性抗氧化物质在不同孵育天数的含量得到以下结果:维生素E(VE)、谷胱甘肽(GSH)、还原型谷胱甘肽(Reduced-GSH)、氧化谷胱甘肽(GSSG)等抗氧化物质在早期含量逐步增加,并且中、晚期其含量下降;不同孵育时间的鸭胚蛋的总抗氧化能力(T-AOC)先升高后下降,第15天达到最高水平。超氧化物歧化酶(SOD)、维生素C(VC)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)含量在孵育期间呈上升趋势。丙二醛(MDA)含量在第18天达到最高值。另外,谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的变化趋势与鸭胚蛋总抗氧化能力的变化趋势大致相同,说明它们可能是决定鸭胚蛋总抗氧化性的关键因素。(2)对鸭胚蛋进行脱脂除杂并超滤后得到不同分子量的鸭胚多肽段ZT1(≤3k Da)、ZT2(≤10 k Da)和ZT3(≤30 k Da),利用DPPH自由基清除能力、总抗氧化能力测定、超氧阴离子和羟自由基清除实验测定了不同肽段的体外抗氧化能力。同时将不同分子量的鸭胚肽段进行细胞毒性实验和对H2O2诱导的Hep G2细胞氧化损伤的保护实验。结果表明:分离得到的鸭胚多肽对Hep G2细胞没有细胞毒性。此外,与ZT2和ZT3相比,ZT1具有更强的清除DPPH自由基、超氧阴离子、羟自由基能力和总抗氧化能力,并通过减少细胞内活性氧积累对H2O2诱导的氧化应激有更强的抑制作用。H2O2刺激的Hep G2细胞中的过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和总超氧化物歧化酶活性呈浓度依赖性增加。(3)对鸭胚多肽段ZT1进行超滤和离子交换柱层析分离得到单个多肽,再经LC-MS/MS质谱机下数据库功能注释、生物信息学预测和热点肽基识别得到具有功能的多肽。结果表明:有413个潜在的功能肽,其中一些多肽同时具有多个潜在功能。通过筛选得出了5条毒性多肽,为后续多肽的使用安全奠定了基础。(4)通过抗氧化肽基序列筛选共得到132条多肽,其中GO数据库注释筛选得到5条抗氧化多肽包含在内。对GO注释得到的5条抗氧化多肽序列进行体外抗氧化功能验证,结果表示5条多肽都具有较强的抗氧化活性,其中LA18、RK14和TD12效果明显。同时在H2O2诱导的Hep G2细胞氧化损伤起到非常有效的保护作用。(5)通过测定TD12对H2O2诱导氧化应激作用的Hep G2细胞中Bcl-2,cleaved caspase-3和cleaved PARP蛋白的影响发现,TD12可通过调节细胞中的线粒体凋亡路径来抑制细胞的凋亡。以上结果表明,鸭胚在孵育过程中将会产生丰富的内源性抗氧化物质,且鸭胚孵育至第15天时表现出的抗氧化能力最强。除了有内源性抗氧化物质发挥的作用,鸭胚中的多肽也展现出很强的抗氧化活性和对H2O2诱导的Hep G2细胞氧化损伤起到保护作用。功能注释、生物信息学预测和热点肽基识别发现鸭胚中富含功能的多肽。通过本工作有助于探索鸭胚生物活性物质,从而进一步提高鸭蛋或其他食品原料的利用价值。
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