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研究背景创面愈合是一个高度协调的病理生理学过程,通常经历凝血、炎症、增殖和重塑四个阶段。正常的创面愈合需成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞等多种细胞参与,并分泌各种细胞因子,有序地调节修复细胞的增殖、迁移和凋亡等;同时维持细胞外基质的沉积与降解之间的动态平衡,最终完成创面愈合。然而,某些因素可导致创面经久不愈或过度愈合而形成瘢痕,属于临床治疗中棘手的问题。炎症反应对创面愈合的调控是一把双刃剑。在创面炎症反应过程中,单核细胞和肥大细胞等炎症细胞清除病原菌等有害物质,并释放细胞因子,协调作用促进创面愈合;而创面炎症调控紊乱则是导致慢性难愈创面发生的主要原因,已证实创面若发生持续性炎症反应,则无法从炎症期过渡到增殖期,而出现难愈。另外,持续的慢性炎症则会诱发过度愈合而产生病理性瘢痕。因此,研究创面愈合过程中的炎症调控机制,对难愈创面及病理性瘢痕的治疗有重要的科学意义和临床价值。创面炎症反应的消退是一个复杂的过程,需要中性粒细胞、巨噬细胞和成纤维细胞等多种细胞协同作用。成纤维细胞作为创面修复过程中主要功能细胞,除了分泌细胞外基质（ECM）参与肉芽组织形成之外,还参与了炎症的调控。创伤早期,成纤维细胞分泌细胞因子募集白细胞,并促进其浸润和活化。另外,成纤维细胞可直接与中性粒细胞接触,参与控制创面炎症。由此提示,成纤维细胞通过分泌因子和直接接触两种途径,既参与创面早期炎症形成,又参与后期炎症消退,但具体的调控机制,特别是炎症消退的调控机制尚不完全清楚。机体免疫应答或者炎症反应是免疫调控动态平衡的结果,近来发现的免疫检查点（immune checkpoint）是机体对抗过度免疫应答或者炎症反应的负性调控机制,在肿瘤逃避免疫监视和自身免疫性疾病发生起重要作用。其中PD-1/PD-L1通路是免疫检查点通路中的关键通路之一,参与维持外周免疫耐受。而目前关于免疫检查点是否参与创伤愈合中的炎症消退调控仍不清楚。我们前期研究发现,创面愈合过程中,成纤维细胞可表达PD-L1,由此提出成纤维细胞可能通过PD-L1信号参与创面愈合过程中炎症调控的假说,但成纤维细胞在创面愈合过程中上调PD-L1表达的机制以及PD-L1信号参与创面愈合中的炎症调控作用机制尚待探明。在创面愈合过程中存在多种细胞因子（如TGF-β、PDGF、EGF、FGF-2、IL-1和TNF等）,对修复细胞进行精确调控以促进伤口愈合。而创面愈合过程中成纤维细胞表达PD-L1是否受部分因子调控仍需进一步探索。同时,已证实,PD-L1的表达主要通过翻译水平调控,那么创面愈合过程中成纤维细胞表达PD-L1是否依赖蛋白质翻译调控也需进一步研究。有证据表明,巨噬细胞全程参与创面愈合过程中炎症反应,特别是在炎症反应后期。巨噬细胞既要吞噬凋亡细胞,又要进行表型和功能上的转变,由M1型（促炎型）极化为M2型（抑炎型）,而PD-1/PD-L1通路在巨噬细胞极化调控中发挥重要作用,为此我们进一步推测创面愈合过程中成纤维细胞通过表达PD-L1,介导巨噬细胞极化,参与创面炎症消退调控,最终促进伤口愈合。二甲基亚砜（DMSO）是一种广泛使用的溶剂,归因于其高度极性亚基的存在,能够溶解多种溶解度低的化合物,如药物,抑制剂等。DMSO作为一种潜能药物,曾经也应用于多种肿瘤和急慢性炎症的治疗。然而,由于DMSO的安全性一直未得到充分的肯定,因此,其体内数据依然较少,尚且不能在临床上得到广泛的应用。有研究证实,DMSO能够通过降低促炎因子水平,进而减轻炎症水平,而且,DMSO能够促进创面愈合,但是机制尚不完全清楚。前期我们采用了DMSO作为溶剂来溶解eIF4E抑制剂4EGI-1,惊奇的发现了DMSO单独加入竟有效的促进成纤维细胞的增殖。因此我们提出假设,DMSO可能通过促进成纤维细胞增殖,而增殖的成纤维细胞在细胞因子的刺激下高表达PD-L1,进而调控创面炎症消退,最终促进伤口愈合。研究目的:旨在阐明成纤维细胞在创面愈合过程中通过表达免疫检查点受体PD-L1介导炎症消退,参与创面愈合的作用机制,具体如下:（1）明确创面愈合过程中PD-L1表达的规律,及其在创面愈合中的作用;（2）明确成纤维细胞表达PD-L1的调控因素;（3）探明成纤维细胞表达PD-L1参与创面炎症消退调控的作用机制;（4）研究DMSO促进难愈性创面愈合的具体机制。最终为因炎症调控紊乱所致的难愈创面或者病理性瘢痕的治疗提供新的靶点和理论依据。研究方法:1.制备WT小鼠背部创面模型,采用免疫组化、WB和qRT-PCR检测伤口不同天数PD-L1蛋白和mRNA表达水平,分析PD-L1在创面愈合过程表达规律;WT小鼠和PD-L1-/-小鼠皮下注射LPS制备创面慢性愈合模型,分析PD-L1在创面愈合过程的功能。2.FACS及免疫荧光检测创面组织中PD-L1主要表达细胞;免疫荧光分析PD-L1阳性成纤维细胞和巨噬细胞空间定位;qRT-PCR分析炎性因子TNF-a和IL-6、FACS检测巨噬细胞数目、WB检测巨噬细胞表面标志CD16和CD206随着创面愈合进程动态变化。3.FACS检测创面渗液或联用TGF-β1和FGF-2中断抗体处理MEF细胞PD-L1表达;FACS、WB与qRT-PCR检测TGF-β1和FGF-2处理MEF细胞PD-L1蛋白和mRNA表达;TGF-β1和FGF-2处理MEF细胞与LPS激活的巨噬细胞共培养,FACS和免疫荧光检测巨噬细胞CD16和CD206的表达,ELISA检测TNF-α、IL-6和IL-10的表达;PD-L1-/-小鼠慢性创面愈合模型中,利用RECELL技术回补TGF-β1和FGF-2协同处理的MEF细胞,分析创面愈合进程。4.利用Polyribosome检测TGF-β1和FGF-2协同处理的MEF细胞的多聚核糖体上的PD-L1 mRNA含量变化,IP检测eIF4F的形成,WB检测翻译通路关键蛋白活化及表达,并结合特异性通路抑制剂,探讨TGF-β1和FGF-2翻译水平调控PD-L1表达的机制。5.通过CCK-8检测和划痕试验探究成纤维细胞在不同浓度的DMSO处理后的其增殖和迁移情况,并探讨其相关机制。6.利用7m-GTP的Pull-down实验,探索DMSO对通路蛋白和翻译起始复合物等的影响,并结合特异性通路抑制剂,揭示DMSO发挥作用的机制。7.制备小鼠背部难愈创面模型,分析不同浓度的DMSO对伤口愈合进程的影响。研究结果:1.PD-L1在创面愈合进程中呈现动态表达,而敲除PD-L1显著抑制创面愈合。2.创面组织PD-L1蛋白表达随着愈合进程呈现先升高后降低的动态改变,于伤后5天达到高峰,而PD-L1 mRNA水平无明显变化;3.LPS刺激导致小鼠急性炎性创面愈合速度明显减慢,其中,PD-L1-/-小鼠伤口愈合速度显著延缓,说明PD-L1敲除加重了炎症所致的慢性难愈程度。4.PD-L1在创面愈合炎症调控中发挥重要作用。1)与DC和巨噬细胞相比较,小鼠伤后5天组织PD-L1阳性的成纤维细胞数量明显增多,说明在创面愈合的炎症期向增殖期转化过程中,PD-L1主要定位于成纤维细胞,而且巨噬细胞和成纤维细胞在这个过程中存在空间相关性;2)在创面愈合过程中,与WT小鼠相比,PD-L1-/-小鼠创面组织中炎性因子TNF-α和IL-6 mRNA水平和募集的巨噬细胞数目显著增加,说明PD-L1参与调控伤口愈合过程的炎症反应;另外,PD-L1-/-小鼠创面组织中CD16表达升高且消退时间延后,而CD206表达则减少,说明PD-L1对巨噬细胞极化扮演着重要的角色。5.TGF-β1协同FGF-2上调MEF细胞PD-L1表达,影响巨噬细胞极化,参与创面炎症调控。1)第5天的创面渗液上调MEF细胞PD-L1表达,联合应用TGF-β1和FGF-2中和抗体显著逆转PD-L1的表达;TGF-β1和FGF-2上调MEF细胞PD-L1蛋白水平表达,而mRNA表达水平则无明显变化;2)TGF-β1和FGF-2预处理的MEF愈巨噬细胞共培养后,能够降低巨噬细胞M1比率,升高M2型比率,促炎因子TNF-α和IL-6表达降低,抑炎因子IL-10表达升高,说明TGF-β1和FGF-2处理的MEF能够促使巨噬细胞从M1型向M2型转换;相反,TGF-β1和FGF-2处理PD-L1-/-MEF细胞明显减弱了巨噬细胞从M1型向M2型转换能力,说明TGF-β1和FGF-2刺激成纤维细胞调控巨噬细胞极化依赖PD-L1信号;将预处理的WT和PD-L1-/-MEF细胞固定后降低了其对巨噬细胞极化的调控能力,说明成纤维细胞可能还通过其他途径调控巨噬细胞极化,如释放可溶性因子,然而,其调控水平仍具有显著性差异,说明PD-L1通路在调控巨噬细胞极化中发挥重要作用。3)回补TGF-β1和FGF-2预处理MEF细胞促进炎症条件下PD-L1-/-小鼠伤口愈合,证实了TGF-β1和FGF-2上调MEF细胞PD-L1表达,调控炎症反应,促进伤口愈合。6.FGF-2协同TGF-b通过eIF4E蛋白质翻译通路上调成纤维细胞PD-L1表达。1)通过polyribosome检测TGF-β1和FGF-2联合处理的成纤维细胞,发现多聚核糖体中PD-L1 mRNA的含量明显升高,提示PD-L1的表达调控主要依赖翻译调节;2)FGF-2联合TGF-b显著上调成纤维细胞PI3K-AKT-mTOR和P38-ERK-MNK信号通路相关蛋白的活化和表达,及磷酸化eIF4E表达,而加入eIF4E阻断剂显著抑制上述上调现象,提示TGF-β1和FGF-2通过激活翻译信号调控PD-L1的表达。7.DMSO通过Akt/mTOR激活蛋白质翻译促进成纤维细胞增殖1)成纤维细胞在不同浓度的DMSO刺激后,低浓度的DMSO导致成纤维细胞增殖能力在不同时间点均显著增强,且在5mM时其促增殖能力最强;但是DMSO未影响成纤维细胞的迁移能力。提示了DMSO可以促进成纤维细胞增殖2)DMSO刺激成纤维细胞24h后,发现AKT/mTOR的磷酸化水平显著上升。提示,DMSO能够通过AKT/mTOR信号通路促进成纤维细胞增殖。加入mTOR/AKT信号通路的抑制剂Rapamycin后,发现,p70S6K的磷酸化水平得到了抑制。提示,DMSO能够通过AKT/mTOR信号通路促进成纤维细胞增殖。3)通过7M GTP的Pull-down实验表明,DMSO诱导了4EBP1的磷酸化,促进了翻译起始复合物eIF4F的形成,而加入Rapamycin同时也抑制了DMSO对4EBP1磷酸化和形成活性翻译起始复合物eIF4F形成。提示了,DMSO能够通过AKT/mTOR信号通路激活蛋白质翻译从而促进成纤维细胞增殖。8.DMSO促进小鼠难愈性创面的愈合,而加入mTOR信号通路的抑制剂Rapamycin能够抑制其促愈的作用。研究结论:1.在创面愈合进程中,尤其在炎症期向增殖期转化过程中,PD-L1阳性的成纤维细胞通过接触巨噬细胞调控炎症反应而影响创面愈合;2.TGF-β1和FGF-2是诱导成纤维细胞表达PD-L1关键因素,TGF-β1协同FGF-2在翻译水平上调成纤维细胞PD-L1表达,促进巨噬细胞由M1转化为M2,导致炎症期向增殖期转化,促进伤口愈合;3.本研究证明在伤口愈合过程中,PD-L1通过调控炎症反应,促进伤口愈合,为因炎症调控紊乱所致的难愈创面或者病理性瘢痕的治疗提供新的靶点和理论依据。4.DMSO通过Akt/mTOR信号通路激活蛋白质翻译,显著促进成纤维细胞增殖,而大量增殖的成纤维细胞可以通过其表面高表达的PD-L1配体调控创面炎症,从而促进伤口的愈合。为创面愈合的调控提供了新的机制。