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胃癌（Gastric cancer,GC）是一种发生率较高的恶性肿瘤,也是中国最常见的消化系统肿瘤。近10余年来,随着幽门螺杆菌根治标准方案的普及,全球范围内胃癌发生率在逐年下降,但我国仍是胃癌高发地区。虽然靶向药物及免疫药物已广泛用于临床,胃癌患者的五年生存率仍不理想。胃癌的转移和耐药是临床常见且突出的问题,也是影响胃癌患者远期生存的重要原因。因胃癌起病隐匿,早期无特异症状,临床确诊时部分患者已伴有远处转移,因此转移是GC第一致死因素。针对胃癌转移这一特性,寻找切实有效的治疗方法迫在眉睫。化疗是辅助治疗GC的传统方式,因其确切的治疗效果使其在临床上广泛使用,然而治疗过程中耐药现象普遍存在,是胃癌患者预后不良的重要原因。因此,寻找和开发新的靶向药物,通过提高患者对传统化疗药物的敏感性以改善患者生存具有良好的临床应用前景。表观遗传层面的动态调节是一种广泛存在,参与多种肿瘤恶性生物学行为的修饰方式,因此通过表观靶向治疗来解决胃癌肿瘤细胞转移和耐药问题,提高胃癌患者的远期生存率是新一代分子靶向药物研发的新方向和新热点。BRD4是BET家族中的一员,其通过识别乙酰化组蛋白和非组蛋白发挥表观调控的作用。BRD4经典的调控方式为通过溴结构域识别第27位赖氨酸发生乙酰化的组蛋白H3,富集到普通增强子和超级增强子区域,募集调节复合物以及RNA聚合酶Ⅱ进而发挥其“表观基因组阅读器”的作用,在转录水平激活下游基因的表达;除组蛋白外,BRD4亦可识别并结合发生乙酰化修饰的非组蛋白snail,发挥多种调控作用。我们前期研究发现,胃癌细胞异常表达的表观识别蛋白BRD4通过识别乙酰化的EMT相关蛋白snail,抑制其泛素化降解,稳定snail的蛋白表达,促进胃癌转移特性;在细胞层面,BRD4特异性抑制剂JQ1通过抑制BRD4与snail结合,促进snail降解,抑制胃癌细胞迁移、侵袭能力,但JQ1在动物体内的效应尚不明确。因此本研究的第一大部分,我们将基于前期研究基础,探索靶向BRD4-snail轴抑制胃癌转移的临床转化点。此外,除了前文所述BRD4-snail轴在胃癌转移中的作用,BRD4是否还参与了胃癌化疗耐药的调控,以及其中的潜在机制尚不清楚。因此,本研究第二大部分将从BRD4-SOX9轴在胃癌细胞耐药中的作用,JQ1靶向BRD4-SOX9轴改善胃癌细胞耐药和BRD4调控SOX9的分子机制这三个维度进行阐述。本文基于“表观基因组阅读器”BRD4及特异性抑制剂JQ1,探索并阐述BRD4促进胃癌进展的新机制,同时发现靶向BRD4可有效抑制小鼠胃癌肿瘤转移模型的远处转移和提高小鼠对传统化疗药物顺铂的敏感性,为临床治疗进展期胃癌患者提供了新思路。方法一、JQ1靶向BRD4-snail轴抑制胃癌运动侵袭能力Transwell迁移与侵袭实验和小鼠腹腔肿瘤转移模型用于检测JQ1对BRD4-snail轴以及胃癌细胞转移的影响。二、探索BRD4-SOX9轴在胃癌细胞耐药中的作用该部分,TCGA数据库,RNA测序分析和IHC运用于分析BRD4和SOX9之间的关系;WB和RT-PCR用于比较野生型和耐药胃癌细胞之间BETs和SOX9表达差异以及基于siBETs探索BRD4对SOX9的调控作用;CCK8、软琼脂克隆形成和平板克隆形成用于验证SOX9在胃癌耐药中的作用。三、验证JQ1通过BRD4-SOX9轴促进胃癌细胞的顺铂敏感性该章节,WB和RT-PCR用于检测JQ1对SOX9及其下游干性基因表达的影响;CCK8、软琼脂克隆形成和平板克隆形成用于检测JQ1和顺铂联合用药的效果;WB用于检测联合用药对细胞凋亡的作用;小鼠皮下成瘤模型用于检测联合用药在体内的效果。四、BRD4-SOX9轴促进胃癌细胞耐药机制探讨此部分,IHC和ChIP测序用于寻找SOX9和H3K27Ac的关系以及探索SOX9基因座上H3K27Ac信号。结果一、JQ1靶向BRD4-snail轴抑制胃癌运动侵袭能力1.过表达snail后,JQ1对胃癌细胞迁移和侵袭抑制作用减弱;2.小鼠腹腔转移模型中,JQ1显著抑制胃癌细胞腹腔种植;二、BRD4-SOX9轴促进胃癌细胞耐药1.BETs调节SOX9的表达（1）RNA-seq提示SOX9与BRD4表达之间存在高度相关性;（2）基于TCGA数据库分析,BETs与SOX9 mRNA之间存在相关性;（3）基于组化分析,BRD4与SOX9之间存在相关性;（4）小干扰RNA敲低BETs后,SOX9 mRNA和蛋白水平出现不同程度的抑制;（5）质粒过表达BETs后,SOX9 mRNA和蛋白水平出现不同程度的增加;2.BRD4和SOX9在胃癌耐药细胞中表达上调（1）BETs、SOX9在胃癌耐药细胞中蛋白表达水平明显高于野生型肿瘤细胞;（2）在胃癌耐药细胞中敲低BETs同样抑制SOX9的表达;3.SOX9异常表达促进肿瘤细胞顺铂耐药（1）顺铂处理下,敲低SOX9的胃癌耐药细胞活性和增殖能力明显低于对照组肿瘤细胞;（2）顺铂处理下,过表达SOX9的肿瘤细胞活性和增殖能力明显高于对照组肿瘤细胞;三、JQ1靶向BRD4-SOX9轴提高胃癌细胞对顺铂的敏感性1.顺铂联合JQ1处理后,胃癌耐药细胞活性和增殖受到明显抑制;2.顺铂联合JQ1处理后,胃癌耐药细胞凋亡水平明显上升;3.小鼠皮下成瘤模型中,顺铂联合JQ1处理后,肿瘤体积明显缩小;4.小鼠皮下成瘤模型中,顺铂联合JQ1处理后,肿瘤Ki67指标明显下调;四、BRD4-SOX9轴促进胃癌细胞耐药机制浅谈1.基于组化分析,SOX9与H3K27Ac存在相关性;2.基于ChIP-seq,胃癌耐药细胞的SOX9基因座上H3K27Ac峰明显高于胃癌野生型细胞;结论一、JQ1通过降低snail蛋白稳定性进而抑制胃癌转移。二、BRD4与SOX9表达存在高相关性,BETs和SOX9在耐药细胞中表达上调,并且通过调节SOX9的表达参与胃癌细胞耐药发生。三、JQ1联合传统化疗药物顺铂靶向BRD4-SOX9轴能提高胃癌细胞对顺铂的敏感性。四、耐药细胞SOX9基因座存在H3K27Ac信号异常富集。