【摘 要】
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目的:肝纤维化是多种肝脏疾病的病理特征,其本质是肝星状细胞分泌的细胞外基质（ECM）代谢失衡,合成增多而降解减少。肝星状细胞（HSC）活化是肝纤维化发生发展的关键细胞学机制,本课题组前期通过全基因组表达芯片分析,在活化肝星状细胞中找到差异性表达的自噬相关基因BNIP3。Bnip3（Bcl-2/腺病毒E1B-19k Da相互作用蛋白3）是参与调节细胞自噬、凋亡和基因转录调控的多功能分子,我们推测在肝
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目的:肝纤维化是多种肝脏疾病的病理特征,其本质是肝星状细胞分泌的细胞外基质（ECM）代谢失衡,合成增多而降解减少。肝星状细胞（HSC）活化是肝纤维化发生发展的关键细胞学机制,本课题组前期通过全基因组表达芯片分析,在活化肝星状细胞中找到差异性表达的自噬相关基因BNIP3。Bnip3（Bcl-2/腺病毒E1B-19k Da相互作用蛋白3）是参与调节细胞自噬、凋亡和基因转录调控的多功能分子,我们推测在肝星状细胞中Bnip3是调控自噬调节肝星状细胞活化的关键分子。本课题旨在探索Bnip3调节肝星状细胞自噬的具体分子机制,揭示肝纤维化发生发展的可能机制,为干预或逆转肝纤维化发生发展提供理论依据。方法:收集临床诊断为肝纤维化的患者肝组织和手术切除肝血管瘤周围的正常肝组织,用免疫组织化学染色法检测肝脏组织中Bnip3的表达;用氯化钴（Co Cl2）化学诱导缺氧或LPS刺激人肝星状细胞系LX-2细胞活化,用胶原酶灌注-Percoll密度梯度离心法分离BALB/c小鼠原代肝星状细胞并在体外培养自然活化;用免疫荧光染色法在激光共聚焦显微镜下观察肝星状细胞中Bnip3、LC3B分子表达及Bnip3和LC3B共定位;用Annexin V-FITC/PI凋亡双染试剂盒染色,通过流式细胞术分析LX-2细胞中凋亡细胞比例,用Western blot检测LX-2细胞内caspase-3和cytochrome C等凋亡相关分子表达;用特异性si RNA干扰小鼠原代HSC中Bnip3表达,GFP-RFP-LC3B质粒转染至细胞内,在激光共聚焦显微镜下观察自噬流;收集缺氧活化的LX-2细胞裂解液,联合免疫共沉淀和质谱技术分析肝星状细胞内可能与Bnip3结合的蛋白;在活化HSC中,用免疫荧光染色和激光共聚焦显微成像技术检测Bnip3和中间纤维蛋白Vimentin的表达和共定位;用免疫共沉淀技术检测Bnip3与Vimentin的结合,以及Bnip3-Vimentin复合物中Vimentin S56、S72、S82和S38等丝氨酸残基磷酸化表达;用Vimentin抑制剂WFA（Withaferin A）抑制Vimentin活性,在缺氧或LPS刺激活化的LX-2细胞中,用Western blot检测Vimentin、Bnip3、LC3B,用免疫荧光染色和激光共聚焦显微成像技术检测Bnip3和LC3B的表达和共定位。结果:Bnip3在肝纤维化患者肝脏组织及活化肝星状细胞中表达升高;肝星状细胞活化过程中发生自噬;活化肝星状细胞中Bnip3与自噬小体部分共定位,抑制Bnip3表达导致自噬流受阻;活化肝星状细胞中Bnip3与中间纤维蛋白Vimentin存在相互作用和共定位;抑制Vimentin活性可抑制活化LX-2细胞中Bnip3表达和自噬发生。结论:自噬相关蛋白Bnip3是肝星状细胞活化过程中调节自噬发生的关键分子,Bnip3通过与中间纤维蛋白Vimentin相互作用调节肝星状细胞自噬。
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