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为推动我国功能性食品的发展,本文以自制的人轮状病毒油乳灭活疫苗为抗原对产蛋鸡进行人工免疫,对特异性IgY的产生规律及性质进行了系统的研究,得出结论如下:
1.以人-Wa株轮状病毒作为抗原,制作油乳灭活疫苗。将所研制的疫苗按油乳疫苗的相关标准进行物理稳定性及安全性检验,结果表明该疫苗具有良好的稳定性及安全性。
2.用该疫苗对产蛋鸡以不同剂量(0.8×104TCID、1.6×104TCID、2.4×104TCID)分别进行翅下皮下、胸部肌肉免疫。免疫程序为初免一次,加强免疫两次,每次免疫时间间隔均为7天。从初免第二天开始收集鸡蛋,用水稀释与硫酸铵两步沉淀相结合的方法提取IgY,并用间接ELISA跟踪检测鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)活性,结果显示:翅下皮下免疫组在初免后的第11天(OD450=0.286)开始出现特异性IgY,胸部肌肉免疫组在初免后的第13天(OD450=0.380)出现。免疫部位对特异性IgY活性变化几乎没有影响,免疫剂量对特异性IgY活性的影响较为明显,0.8×104TCID/mL剂量免疫所得IgY效价明显低于1.6×104TCID/mL和2.4×104TCID/mL剂量免疫的卵黄抗体效价。特异性IgY变化规律:一免后卵黄抗体活性有微弱的升高,一次加强免后活性上升明显,二次加强免后,在两个月的时候特异性IgY活性达到峰值(OD450=1.67),而且维持在较高的活性水平近两个月之后开始下降。
3.SDS-PAGE电泳检测IgY的理化性质结果表明:在低于75℃条件下,抗HRV-IgY性质稳定,在pH<3.0、pH>10的情况下容易发生变性,而在中性和弱碱性环境中有较好的稳定性;胃蛋白酶、胰蛋白酶对抗HRV-IgY的稳定性均具有不利的影响,水解时间越长影响越明显。
4.间接ELISA检测IgY的生物活性结果显示:在低于75℃时,IgY的活性比较稳定,但随着温度的上升,活性迅速下降。IgY在弱碱性、中性和弱酸性条件下都有较高的活性保留率,如IgY在pH4.0-9.0的环境中,4h后,仍保留50%以上的活性。当pH4.0时,胃蛋白酶(15ug/mL)对IgY活性的影响较小,但当pH2.0时,经胃蛋白酶作用1h后其残留活性小于10%。IgY对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的敏感性较pH2.0胃蛋白酶要弱得多,处理6小时后活性保留率仍为60%左右。果糖、葡萄糖、乳糖、糊精均对抗HRV-IgY都具有一定的保护作用。