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目的:酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)为长期大量酒精摄入或短期过量饮酒所致的肝脏疾病,其初期通常表现为脂肪肝,严重者可进展至脂肪性肝炎、肝纤维化甚至肝硬化。酒精引起肝功能损伤的具体机制尚不十分明确,目前有研究发现神经酰胺(ceramide)参与到其发病过程中。神经酰胺属于鞘磷脂类,参与构成生物膜,并为鞘磷脂信号途径中重要的第二信使,能够激活多种蛋白激酶和蛋白磷酸酶如蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A),调节凋亡、增殖等信号过程。乙醇激活酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,ASMase)后,使神经酰胺生成增多,通过蛋白磷酸酶2A影响腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK),使活化的AMPK去磷酸化失活,进而影响到下游一系列脂代谢调节基因,导致肝细胞内脂肪堆积。本研究采用酒精灌胃方式建立大鼠ALD模型,通过分子生物学方法探讨神经酰胺、酸性鞘磷脂酶及蛋白磷酸酶2A在酒精性肝病发病机制中的作用。方法:选择健康雄性Wistar大鼠50只,体重180-220g,经过正常喂养l周之后,随机分配10只作为正常对照组,其余大鼠作为模型组每日灌入酒精,并分别在第4周、8周、12周和16周末处死模型组大鼠10只、9只、8只和8只。取出大鼠肝脏后,用4%中性甲醛溶液固定一部分肝组织,经石蜡包埋后切片,行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色以观察其病理改变,其余组织-80℃保存待用。采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)法检测ASMase、PP2A的mRNA表达水平,免疫组化技术、Western-blot检测ASMase、PP2A的蛋白表达水平。高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)检测肝组织神经酰胺含量。结果:1肝脏组织病理学改变:4周大鼠肝细胞可见脂肪变性,至8周、12周,脂肪变加重,炎症增多并伴随纤维组织增生,至16周,肝细胞呈弥漫小泡性脂变,可见肝窦周围纤维化、汇管区的纤维组织增生,并观察到已形成的纤维间隔。2免疫组化技术检测各指标蛋白表达水平:正常组大鼠肝组织中ASMase、PP2A阳性表达较少,酒精模型组阳性表达量呈增加趋势。3 RT-qPCR法检测各指标mRNA表达的变化:正常组大鼠肝组织中ASMase、PP2A mRNA表达量较少,酒精模型组mRNA表达量逐渐增加,与正常对照组相比较,差异有统计学意义(P均<0.05)。4 Western-blot检测各指标蛋白表达水平的变化:正常组大鼠肝组织中ASMase、PP2A蛋白表达量较少,酒精模型组表达量呈增加趋势,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P均<0.01)。5高效液相色谱-质谱联用法检测肝组织中神经酰胺的含量:酒精模型组大鼠肝内神经酰胺含量逐渐增加,与正常对照组相比较,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论:1应用酒精喂养制备的大鼠酒精性肝病模型,其肝脏脂肪变性、炎症程度及纤维化改变可以基本反映酒精性肝病的病理学改变,应用此动物模型研究酒精性肝病的发病机制具有一定科学性。2应用不同实验方法检测神经酰胺、酸性鞘磷脂酶及蛋白磷酸酶2A的表达水平,结果均随脂变程度的加重而逐渐升高,提示这三者及其之间的相关性可能参与到酒精性肝病的发病机制中。