【摘 要】
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研究背景地表臭氧（Ozone,O3）污染在我国呈逐年加重趋势。大量流行病学证据显示O3吸入暴露可引起机体多系统损伤。近年来O3暴露所致中枢神经系统退行性改变受到高度关注,但作用机制尚不清楚。我国已经进入老龄化社会,老年群体是空气污染以及神经退行性病变的易感群体。呼吸道是机体暴露O3的主要通道,本研究主要探索O3对小鼠呼吸道尤其是中枢神经系统的影响。研究目的以C57BL/6N小鼠为动物模型,应用微生
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（81573112）；
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研究背景地表臭氧（Ozone,O3）污染在我国呈逐年加重趋势。大量流行病学证据显示O3吸入暴露可引起机体多系统损伤。近年来O3暴露所致中枢神经系统退行性改变受到高度关注,但作用机制尚不清楚。我国已经进入老龄化社会,老年群体是空气污染以及神经退行性病变的易感群体。呼吸道是机体暴露O3的主要通道,本研究主要探索O3对小鼠呼吸道尤其是中枢神经系统的影响。研究目的以C57BL/6N小鼠为动物模型,应用微生物组学、转录组学、免疫组织化学和分子生物学等方法,研究O3暴露所致小鼠呼吸道和中枢神经系统毒性效应,为进一步阐明O3所致中枢神经退行性样变机制提供实验依据。研究方法将23只9月龄雄性C57BL/6N小鼠随机分为2组:过滤空气（对照）组和O3组,其中空气组11只,O3组12只。两组小鼠在相同暴露条件下,分别暴露过滤空气和1 ppm O3,每天暴露4小时,连续8周。暴露过程中观察记录小鼠生长状况和精神状态,定期测量体重。暴露结束后,Morris水迷宫测试小鼠空间学习记忆能力;旷场实验测试小鼠探索和焦虑情况;用BCA试剂盒分别测定肺灌洗液、血清和脑组织上清中总蛋白浓度;ELISA试剂盒测定肺泡灌洗液中炎症因子巨噬细胞炎性蛋白（MIP-2）和肿瘤坏死因子（TNF-α）表达水平;16S扩增子测序分析小鼠肠道微生态和肺灌洗液微生态;免疫组化法检测脑组织中p-Tau和Tau表达水平;Western blot法测定脑皮质中α-Synuclein、p-Tau和Tau蛋白水平;用转录组测序检测嗅球和海马组织差异基因表达,并用荧光定量q PCR对差异基因进行验证。用SPSS22.0软件,R和Graphpad5.0对数据进行方差分析、两独立样本t检验、单因素方差分析和Spearman相关性分析。检验水准P=0.05。研究结果1.小鼠暴露期间生长状况:一般生长状况良好,体重和精神状况在暴露期间均无明显变化。2.空间学习记忆能力变化:定位航行实验中O3组小鼠的逃避潜伏期较空气组小鼠略长;空间探索实验中O3组小鼠游过平台位置的次数及相关相限停留时间略有减少,但无统计学差别。说明O3组小鼠空间学习和记忆能力有下降趋势。3.探索和焦虑情况改变:两组小鼠均未表现明显焦虑。4.脑皮质p-Tau、Tau和α-Synuclein蛋白表达水平:同空气组相比,O3组小鼠皮质中p-Tau（P=0.004）和α-synuclein（P=0.040）蛋白水平显著增加。Tau表达量两组间无统计学差异。5.肠道微生态改变:与空气组相比,O3暴露可影响肠道菌群的α多样性（P=0.013）和β多样性（P=0.016）。6.肺组织微生态改变:与空气组相比,O3可影响肺泡灌洗液菌群的α多样性（P=0.042）和β多样性（P=0.056）。7.肺灌洗液炎症因子水平:与空气组相比,O3组肺灌洗液中的炎症因子MIP-2和TNFα浓度显著增加;总蛋白有增加趋势,但无统计学意义。对属水平差异菌和炎症因子表达水平进行Spearman相关分析,发现MIP-2与Aerococcus有显著相关性。8.脑组织基因差异表达:与空气组相比,O3组嗅球组织的差异表达基因143个,其中130个表达上调,13个基因表达下调;海马组织69个差异表达基因,其中64个基因表达上调,5个基因表达下调。O3组海马差异基因功能与42条代谢通路关联,嗅球差异基因功能与46条代谢通路关联。对筛选出的16个差异基因进行了q PCR验证,结果与转录组测序结果一致。结论1.C57BL/6N小鼠暴露1 ppm O3 8周学习记忆能力呈轻微减退趋势。2.O3暴露可引起神经退行性病变相关蛋白α-synuclein高表达和Tau蛋白磷酸化。3.O3暴露可影响嗅球和海马基因表达。4.O3暴露可引起肠道菌群及肺菌群紊乱,其中肺菌群失调与肺炎症反应有关。
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